Técnica de Western Blot

May 28, 2024

Técnica de Western Blot

Introducción

  • Nombre Alternativo: Inmunoblot o Electotransferencia
  • Uso Principal: Detectar presencia de una proteína específica en una mezcla compleja
  • Información Proporcionada: Presencia, tamaño y abundancia relativa de la proteína

Etapas del Proceso

1. Separación de Proteínas

  • Método: Electroforesis
  • Propósito: Separar proteínas por peso molecular
  • Proceso:
    • Incubar proteínas con SDS (sodio dodecil sulfato) para darles carga negativa
    • Aplicar campo eléctrico
    • Proteínas migran hacia polo positivo
    • Separación según tamaño (proteínas grandes migran más lento)

2. Transferencia a Soporte Sólido

  • Soporte: Membrana de nitrocelulosa o PVDF
  • Propósito: Transferir proteínas del gel a la membrana
  • Proceso:
    • Gel y membrana en contacto
    • Aplicar campo eléctrico
    • Proteínas migran del gel a la membrana

3. Detección con Anticuerpos

  • Anticuerpo Primario: Reconoce específicamente la proteína de interés
  • Anticuerpo Secundario: Se une al anticuerpo primario y está conjugado a una molécula detectable
    • Tipos de Detección:
      • Enzimática (color o quimioluminiscencia)
      • Fluorescencia
      • Radioactividad

Resumen de Pasos del Western Blot

  1. Electroforesis: Separar proteínas por peso molecular
  2. Transferencia: Transferir proteínas a una membrana
  3. Bloqueo de la Membrana: Usar una proteína inocua para evitar unión inespecífica
  4. Incubación con Anticuerpo Primario: Unión a la proteína de interés
  5. Lavado: Remover exceso de anticuerpo primario
  6. Incubación con Anticuerpo Secundario: Unión al anticuerpo primario
  7. Lavado: Remover exceso de anticuerpo secundario
  8. Detección: Visualizar la ubicación del anticuerpo secundario

Diferencias con el SDS-PAGE

  • SDS-PAGE: Muchas bandas de proteínas
  • Western Blot: Una sola banda si la proteína de interés está presente

Aplicaciones del Western Blot

Diagnóstico

  • Enfermedades Infecciosas: Diagnóstico de VIH mediante detección de anticuerpos en el suero del paciente
  • Especificidad Alta: Uso como método confirmatorio

Investigación Fundamental

  • Activación de Vías de Señalización: Detección de proteínas fosforiladas
  • Proteínas Recombinantes:
    • Producción en laboratorio mediante ingeniería genética
    • Análisis de condiciones de producción

Conclusión

  • Nombre del Expositor: Mencionado en la diapositiva inicial
  • Contacto: Disponible para resolver dudas