Доброго дня, шановні студенти! Сьогодні до вашої уваги хімічна тема, яка стосується синтезу нуклеозидів, нуклеозид фосфатів та олігонуклеотидів. Нагадаю, що нуклеозидами називаються продукти конденсації нуклеїнових основ із вуглеводами, з цукрами, зокрема...
і в першу чергу з рибозою, дезоксирибозою, але можуть бути і інші вуглеводи. Н-глікозиди, загальний клас. Н-глікозиди це сполуки фосфорольовані за одною або за кількома гідроксильними групами у цукрі, у вуглеводі. Найчастіше зустрічається... нуклеозид 5,4-х фосфат, тобто по п'ятому положенню рибози.
Ну, а олігонуклеотидами називають полімери нуклеозид-фосфатів. Власне, олігонуклеотиди це короткі за довжиною нуклеїнові кислоти, які при PH7, звичайно, перебувають у депротонованій форі у вигляді поліаніонів. Так от, почну по порядку. Спочатку синтез нуклеозидів, потім нуклеозид фосфатів різних і врешті синтез олігонуклеотидів. Щодо біосинтезу нуклеозидів та нуклеотидів, я планую зробити окрему лекцію, зараз їх розглядати ми не будемо.
В першу чергу, звичайно, мова буде йти про синтез. рибонуклеотидів, і потім ми розглянемо окремо, як же синтезують два штрих дезокси рибонуклеотидів. Цим питанням науковці займалися вже давно, мабуть, з початку, а може навіть і з кінцями позаминулого століття, тобто з 1800-х років, ще з перших десятиліть зародження.
органічної хімії, як тільки, ну це не перші дистилі, я думаю, що це було десь через, вже на початку дев'ятсотих серйозна справа пішла, коли розпізнали будову нуклеїнових кислот, коли їх виділили і проаналізували. Ну і з тих пір почали розробляти методи синтеза нуклеозидів, ну і я вам скажу, і інших, гелікозидів інших похідних, зокрема спиртів та фенолів теж. перші розробки були здійснені в той час і трохи раніше. Так от, зараз найбільш поширеними, класичними, можна сказати, і найбільш ефективними методами синтеза нуклеозидів є реакція Селіл Гільберта, або кажучи, Джилберта Джонсона, і реакція Форбругіна.
де використовуються сирильовані гетероциклічні основи та електрофільні повхідні рибози. І обов'язково має бути кислота Льюіса у системі. Найбільш поширеним методом є застосування тетрахлориду олова у дихлоретані. От верхня схема якраз і показує синтез аза урацилу.
Припошую азаурідіну, бензильованого, бензоїльованого азаурідіну із азаурацилу і 1-о-ацетил-тетра-бензоїл-рибопіранози. Так от конденсація проходить із високим виходом за низьких температур, при кімнатній температурі або при слабкому нагріванні. При виділенні оцієї бензіюльованої пахильної додають у суміш, промивають суміш гідрокарбонатом натрію для того, щоб позбавитися від наближку тетраметилхлорсилану, який завжди застосовується, і гідролізувати хлорид олова.
Потім, якщо треба отримати власне нуклеозит водним аміаком, аміакому водному розчині знімають бензогільний захист. Механізм цієї реакції показаний внизу слайду. Краще замість 3-метилсилів хлориду використовувати 3-метилсилів трифлат, який взаємодіє з ацетильованим вуглеводом і фактично знімає ацетильну групу, перетворюючи вуглеводу в карбокатіон, показаний тут посередині слайду.
Отакий от трифлат. активна форма, мезомерні структури цього карбокотіону можете самі намалювати. Тут одна з них показана, інша це коли заряд плюс на глікозидному атомі карбону, він тут стабілізується ендоциклічним атомом оксигум. Так от, ця сполука атакується силільованим. селілюваною нуклеїновою основною.
Триметилселільний захист прибирає нуклеофільність атомів оксигена. І ще навіть може селілюватися атом нітрогену. І це теж буде активна форма, бо нуклеофільність атома нітрогену при цьому не зменшується. Так от, в тій чи війної формі...
Дякую. Нуклеїнова основа реагує із активованим вуглеводом, утворюючи ацельований нуклеозид із захищеним атомом оксигену. З захищеним одним або двома захищеними атомами оксигену.
І саме цей захист знімається при обробці карбонатом натрию. Але можливо також подвійне глікозолювання і побічний продукт подвійного глікозолювання, який утворюється в невеликих кількостях, тут показаний на слайді продукт 3. От такий механізм, от така стереохімія взаємодії за реакцією Селін Гільберта Джонсона. Перед тим, як показати інші методи. Ще в мене є слайд, де показано недоліки цієї реакції.
Один з недоліків вже було видно на попередньому слайді. А ще, якщо в нас є скільки нуклеофільних атомів нітрогену, тоді можуть утворюватися ізомерні продукти. Приклад ізомерного продукту це на верхній реакції такого… триазину, взаємодії селінового триазину, в тих же умовах Сіліл Гільвер та Джонсона, з утворенням іншого ізомеру.
Щоб позбавитися від побічних продуктів, краще встановити захист на один із нуклеофільних атомів нітрогена. В даному разі внизу показано, що захист встановлен на той атом нітрогена, який взаємодіє і, краще, швидше, легше, ціаноетильний захист на нього перший встановлюється, ну і після цього гликозилювання, а точніше рибозилювання ацетохлор рибозою, це ще один метод, коли галоген ацетохлор рибоза використовується при такому селілюванні. При такому гликозалюванні однозначно твориться один продукт.
Правда, ацетохлорцукри високих виходів не дають у цій реакції. Інші варіанти синтезу це такий давній метод сплавляння ацетильованого вуглеводу із нуклеїновою основою. Високі виходи… Дещо багато побічних продуктів. Треба гарно постаратися при виділенні сполуки. І триацильований нуклеозид виходить з середнім виходом.
Або ж використовують бензильовані або толуїльовані, тобто алкільний захист. Алкільний захист використовують для цукрів. В даному разі показано два дезоксії, один хлор рибоза захищена. Так от, при взаємодії з натриєвими солями, в ацетонітрилі, м'які умови, кімнатна температура, вихворюється нуклео. то лільний захід знімає гідрування в даному разі, ну і можливість утворення ізомеру замість бета-нуклеозиду, утворення альфа-нуклеозиду в даному разі існує.
Для всіх дезоксирибозидів існує можливість утворення альфа-і бета-ізомерів, ті чи інші. мірі інколи один до одного а от для для ацетатів і бензоатів коли тут ацильний захист положені два рибози то тоді однозначно утворюється бета-нуклеозид як показано на слайді Ну це завдяки тому що оцей ацетильний або бензоїльний замісник він направляє в бета-положення Нуклеофіл, як це показано на одному з попередніх слайдів у механізмі реакції Гілберта Джонсона. Ідемо далі. Як синтезують дезокси рибонуклеозиди? Ну от, наслідок того, що тут, можливо, утворення альфа-аномерного нуклеозиду замість бета, тут інколи це буває один до одного співвідношення аномерів.
Тут існують такі складнощі, які долають шляхом елімінування гідроксильної групи, видалення гідроксильної групи з положення 2. Це треба робити за кілька стадій. От перша стадія, бачите, встановлення селінного захисту на положення 3 штрих і 5 штрих рибози. Вихід, на жаль, не дуже великий. Ну і після цього радикальне відновлення взаємодія з трибутилстананом у присутності азобіс-ізобутиронітрилу як джерела радикалів. Остання стадія це зняття захисту, сіліньного захисту тетрабутиламоній фториду.
Ось така схема утворення у синтезу 2-3 дезокси рибонуклеозидів. Аномальні нуклеотиди це широка популярна тема досі, починаючи, мабуть, з 50-х років минулого століття. Популярна тема це синтез аномальних нуклеозидів і нуклеотидів. Аномальні нуклеозиди і нуклеотиди часто володіють високою біологічною активністю.
Зокрема, ви, мабуть, знаєте, препарати азоцихідін це протипухлинний препарат. І є інші препарати проти ковіду, проти інших вірусів, проти грипу, антиракові препарати. І все це препарати, що містять аномальні нуклеотиди або самі є аномальними нуклеотидами.
Ось, як, наприклад, тут із два аміно-рибози, один дезоксид, два аміно-рибози. після обстановлення селільного захисту формують гетероцикл, формують тиміновий гетероцикл, нуклеїнову основу в положенні 2 і таким чином отримують аномальний нуклеотид. Синтезів тут багато.
Є сцену нуклеотиди, коли, наприклад, той же самий... Тимін, але вже положенням 6, прив'язаний до карбону в положенні 1. Є такі аномальні нуклеотиди. Є на основі аденіну аномальний нуклеотид, вже ферментативним методом отриманий із аномального тимідіну. за схемою, яка показана тут на слайді внизу.
Або мені пощасливилось, коли я відразу після закінчення навчання, отримання диплому випускника, тоді, вважайте, магістра хімічного факультету, в Інституті молекулярної біології і генетики мені доручили синтез 9-бета-Д-арабофоронозиладеніна. Із всіх методів, які були знайдені мною в літературі, оптимальним, не самим коротким, не самим лаконічним, але найбільш ефективним, надійним, всі стадії можна було реалізувати. І от виявився такий метод, коли беруть вихідною сполукою аденозін, ось він, перший, його бромують.
в положення ецечленного циклу. Потім встановлюють сілільний захист на гідроксили 2 і 3, діючи дибутилстананоксидом. І після цього, діючи паратулолсульфохворидом, отримують тозелат.
за положенням 2. Виходи, які в мене вийшли, я тут показую в цифрах на кожній стадії. Виходи високі, бачите, виходи високі на кожній стадії. Потім цей тозелат в присутності основи ацетату натриї, воцтову мангідриді, перетворюють на гідроксипохідну гідроксил.
в аденозивному циклі. І дією на цю сполуку аміаком метанолі циклізують її, перетворюючи на циклоарабінофорнозит. Отаку біциклічну сполуку.
Далі цикл треба розімкнути вдало. Роблять це з допомогою гідрозину. в етанолі.
І врешті треба гідрозиновий залишок ліквідувати із цієї молекули. Роблять діючим оксидом ртуті у водному етанолі. І те, що тут, бачите, скрізь виходи височені, отримують аденінарабінофорозензит. З загальним виходом досить високим, якщо врахувати всі стадії.
От я так от близько одного грама сполуки із 20 грамів вихідної сполуки і отримав. Чим порадував завідувача відділом хімії нуклеотидів, нуклеозидів і нуклеїнових кислот Володимира Пантелеєвича Чернєцького. Світла пам'ять йому.
Я їм досі вдячний за науку. Це був синтез нуклеозидів. Тепер перейдемо до синтезу нуклеозид моно, ди та три фосфатів. Огляд на цю тему я вам навів на слайді. Навіть не один, да, один огляд.
Посилання на цей огляд досить свіженькі, я навів. Так от, на цьому слайді показано, які сполуки є найбільш популярними, які синтезуються в лабораторіях, а потім використовуються біологами, біохіміками, біофізиками у різних дослідах. Тут є, бачите, і циклічні фосфати, перший слайд, 5-штрих циклофосфати, тут є.
і поліфосфати з двома нуклеозидами, тут і флавін-аденін-диноклеозид, і флавін-аденін-мононуклеозид, і нікотинамід-диноклеозид, і тощо. Багато сполук, синтез цих сполук зараз... поставлений на високому рівні в лабораторіях окремих компаній, і вони продаються у... інтернеті, різним лабораторіям. Так от, що до синтезу.
Мононуклеотид монофосфатів. Одним із популярних синтезів, де все виходить гладко і не треба мучитися чистити хроматографічно чи ще якось, це є твердофазний синтез нуклеотидів. або ж сивти з урощені і з розчинною підтримкою. Оці два вихідні сполуки тут показані.
Зліва це смоли, це полімерні смоли, якими заповнюють колонку. Ну і далі чіпляють сюди до активного кінця колонки. залишок фосфату, активують його, синтезують нуклеозид і знімають із колонки продукт реакції.
Твердофазний синтез, він тим і знаменитий, тим і зручний, що при його застосуванні очистка кінцевої сполуки дуже проста. Або взагалі не треба, не потребує продукт реакції очистки. А чим складний твердофазний синтез?
Це тим, що треба мати набір твердофазних носіїв і треба вміти з ними працювати. Треба їх закупити, вони дорогі, і мати досвід у використанні твердої фази. Ну так от, дивіться, як синтезують нуклеотиди.
Використовуючи похідні або тривалентного фосфору, вони зверху, фосфіти, фосфорамідіти і аж фосфонати. Або ж похідні п'ятивалентного фосфору, фосфати і фосфорамідати. При цьому утворюються проміжні продукти у синтезі, показані для п'ятивалентного фосфору синім кольором і для тривалентного.
фосфору червоним кольором. Приклад реакції утворення нуклеозид 5,3-х монофосфату внизу наведено. Для цього використовується 3-естер фосфорної кислоти, наприклад, триметилортофосфат. Каталізатор, який активує 5 штрих ОН-групу, утворюючи такий донорно-акцепторний комплекс із нуклеїновою основою, із найбільш нуклеофільним атомом нітрогену в нуклеїновій основі. І активує цим самим 5 штрих положення, але не зачіпаючи положення 2 штрих і 3 штрих.
Це дозволяє проводити реакцію в м'яких умовах, за низьких температур, 0,4 градусів Цельсія, використовуючи просту сполуку фосфору-3-хлороксид. Звичайно, що при цьому залишається ще два хлори в продукті реакції, які треба негайно гідролізувати і потім довести pH до нейтральної. і лише після цього виділяти продукт реакції 5,4-нуклеозид 5,4-монофосфат. Інші схеми синтезу нуклеозид-монофосфатів полягають у використанні більш складних похідних 5-валентного фосфору, такі як, наприклад, захищений хлоро...
фосфат 9. Два різних типи захисту, морфоліновий і триброметиловий, дозволяє однозначно, з високим випадом, профосферлювати 5-3 гідроксил рибози, і після цього треба залишається лише зняти захисні групи. Першу знімають відновленим цинку. За кімнатної температури морфоліну знімають кислотним гідролізом, теж за кімнатною температурою цільові фосфати, які саме тут перераховані внизу похідні аденозину. Внизу показана інша схема, де використовується монозахищена похідна.
фосфорної кислоти, а саме з ціаноетильним захистом. Зато треба захистити, закрити гідроксили 2-3-3 у рибозі нуклеозиду. В такому разі дециклогоксил карбодіемід досить довго, за 2 дні, а зато з високим виходом дозволяє отримати після зняття захистів і високого виходу дозволяє отримати після зняття захистів.
дуклеозид 5,4-монофосфат. Ну, зато швидко, 30 хвилин. Там кілька днів, а тут 30 хвилин, і все готово.
Ще одна схема синтезу із застосуванням вже складних забудовою реагентів, таких як трізопропіл, бензин, сульфоніл, тетразоліт. Це активуючий гідроксильну групу 5-штрих-АГН, а в якості захищеного похідного п'ятивалентного фосфору беруть таку диметоксид тритилетил сульфон. Такий складний сульфон.
Ну от, сполуки реагують. Йде алкалювання однієї з кисень фосфатного залишку і утворюється продукт реакції, після чого концентрованим аміаком знімають ацетильний захист і оцей складний сульфоновий захист одночасно. Ну і тут написано, бачите, що для деяких треба навіть підвищену температуру і концентрований аміак. і це у нас для похідних, Н-бензоїльних похідних цитідіну і гуаніну.
Або значно простіший метод синтезу із нуклеозидів, використовуючи дибензильовану похідну. В даному разі треба використовувати карбодіамід і трифенілфосфін, в яких умовах відбувається реакція. Гексаметилфосфорамід як розчинник.
Канцерогенний розчинник тут застосований, що небезпечно. Але продукт з високим виходом утворюється. І після зняття бензильного захисту над паладі отримують кінцевий нуклеозин монофосфат. Або, наприклад, ще синтез із застосуванням уже тривалентного фосфору, похідних тривалентного фосфору, які...
значно активніше і тут, дивіться, взято замість рибози, взято таку цікаву біциклічну похідну рибозу. Ну, щоб провести все акуратно з високим виходом, була взята похідна фосфітамідіт у тривалентному фосфору, тетразол як активуючий агент. І ось, бачите, від 20 хвилин до 6 годин триває синтез. Перша конденсація з похідною тривалентного фосфору, а потім метахлор пербензойна кислота окиснює фосфор до притолевентного стану і в кислих умовах знімає ізопропіліденовий захист. Третбутильний захист теж в кислокомогу знімається.
Ну і ось бачите, які продукти синтезували таким методом. Або використання цикла... Цикл соліцильного захисту для похідних тривалентного фосфору. От така похідна фосфітохлорид зручно використовувати.
Що зручно тут? Всі синтези тривалентним фосфором треба проводити в безкісневій атмосфері під аргоном. є незручність. Тим не менше, ось показано, що після встановлення, точніше після приєднання до дізапропіламіну можна далі використовувати цей саліцильний захист і для похідних п'ятивалентного фосфору. Але в випадку фосфорювання нуклеозидів і їх аналогів краще використовувати похідні тривалентного фосфору з високим виходом приєднання фосфітного залишку, який далі...
пербензойною кислотою або оксоном, теж окислювальний агент, переводять у п'ятивалентний фосфор. Ось такі синтези. Ще один приклад це синтез аналога, досить лабільного аналога нуклеотиду, використовуючи H-фосфонати. Ось H-фосфорнат в лужних умовах, в присутності пірідину, в основних умовах, йде реакція фосфорювання.
І далі треба НОБ з триметів цілів ацетабіда закривати кисні для того, щоб на останній стадії провести окиснення тривалентного фосфору. Трикординового фосфору, чотирикординового п'ятивалентного фосфору. Агент, який тут застосовували, його структура наведена внизу слайду.
І, як ви розумієте, оцей трицикл оксазирідіновий, він якраз і забезпечує окиснення фосфору до п'ятивалентного стану. Твердофазний синтез нуклеосид монофосфатів через імідофосфіти, показаний на даному слайді. Тут треба старно підбирати твердофазний носій та лінкери на ньому.
Як бачите, скрізь застосовуються амідні лінкери амідного типу. Вони найефективніші. А активна формула фосфіту, ось показано, це у нас діізопропіл амідіт. От саме він.
є найбільш активним. Саме тут амідний залишок при атації гідроксильною групою, активованою тетразолом, відщеплюється найефективніше з утворення атакової похідної нуклеозиду, в який далі треба тривалентний фосфор перевести в п'ятивалентний. відщепити готовий нуклеозид фосфат від твердофазного носія.
Що роблять для таких лінкерів, показаних тут, астерного типу, роблять з допомогою метилату натрію діоксані. От такий твердофазний синтез нуклеозид монофосфатів. або ще один імідофосфітний метод, в даному разі вже використовують більш зручну похідну, правда тут тіольна похідна, зато одночасно закривають обидва положення тривалентного фосфору. Після реакції з... Нуклеозидон утворюється продукт реакції, тут нуклеозид показано як ОНУ, і ще окиснювання, переведення фосфору у п'ятивалентний стан, і далі зняття нуклеозиду із твердофазного носія.
Таким чином можна синтезувати як нуклеотиди, так і дезоксирибонуклеотиди, як показано для дезоптитімідіна. Дифосфати, як синтезують нуклеозид дифосфати? Шляхом застосування похідних пірофосфорної кислоти.
В даному разі це у нас 3-стре-бутил-амоній-пірофосфат. В ацетонітрилі взаємодія із тозильованою похідною нуклеозида, 5-штрих-отозил-нуклеозидом, це активація. 5 штрих положення таким чином здійснюється, нуклеофільна атака і синтез 5 штрих нуклеозид дифосфата. От лаконічний простий синтез, правда час досить довго, час тривалість синтезу досить велика. Щоб прискорити, ось вам метод внизу.
От коли на нуклеозид діють ПО-хлор. Ну і знову ж таки, як я показував на попередніх слайдах, іде каталіз триметилортофосфатом, каталіз, активація положення 5-3. І утворюється дифосфат після того, як утворена сполука взаємодіє.
із тетрабутиламоній фосфатом, диметилформаміні. А що на останній стадії? На останній стадії проводять зняття, зняття, мабуть, захистів чи дезактивацію. дезактивацію хлора, що залишився на стадії-стадії, тетраетила, моніброміту при PH7. Нижня схема показує, як використовують імідозольну активацію карбодіамідозолом, нуклеозид монофосфата, встановлення...
Тут одночасно встановлюється карбонатний захист на гідроксили 2-3-3. Ну і після взаємодії з цією похідною, з амонійною тетра-бутиламонією ортофосфатом і подальшого зняття захисту отримують нуклеозин з високим використанням. Більш складніший синтез дифосфатів, зато більш ефективніший в плані, що не треба додаткової очистки сполуки.
Це використання такої похідної пірофосфорної кислоти, де у нас два положення є активованими, а кисні є захищеними ціаноетильним захистом. Так от, в присутності тетразолу цю сполуку закріплюють на твердій фазі, при цьому залишається один фосфор у активованому стані, і проводять далі взаємодію із нуклозидом в тетрагідрофурані ДМСО, і знову ж таки застосовуючи активацію тетразолом. нуклеозидом.
І утворений нуклеозид дифосфат. в захищеному вигляді, далі знімають із твердої фази, діючи, перепрошую, тут не фосфат, тут фосфіти, це ж в нас імідофосфітний метод, тому фосфіти, а фосфіти треба окислити, спочатку перевести в п'ятивалентний стан, а далі зняти з твердої фази, тривторостовою кислотою в диклоритані, знімають і отримують. кінцевий продукт реакції. Це був твердофазний синтез нуклозид дифосфатів імідофосфітним методом. Ще один метод це застосування тих же самих саліцивного захисту до синтезу дифосфатів.
В даному разі встановлюю сукцінильний захист на положення 3 штрих, потім знімаю диметокситритильний захист з положення 5 штрих, фосфорилюю положення 5 штрих, похідную тривалентного фосфору. Після чого, використовуючи, в даному разі я помилися, це сукцинильна активація. Далі встановлюють на тверду фазу через проложення 3 штрих. І після зняття силиційного захисту фосфорилюють ще раз, отримуючи...
нуклеозид дифосфат. Ну, а загальна схема твердофазного синтезу нуклеозид монод дита трифосфатів показана на даному слайді 24, і вона полягає в тому, що похідну цитідіну закріплюють на розчинному в органічних розчинниках. твердоносієві.
Після активації фосфату, 5-стрик фосфату, карбодіамідозолом проводять конденсацію із фосфатним залишком 3 бутил фосфату. ортофосфату, ну і після цього отримує цільову споловку. Ну а далі можна провести синтез і отримати трифосфат, цитідін-трифосфат, не знімаючи, перед зняттям доконденсувавши ще один залишок. Трифосфати нуклеозитів найкраще... отримувати із застосуванням ПО-ХЛОР-3 та похідної пірофосфорної кислоти.
І через циклічний трифосфат, показаний на слайді, після обробки тетраетіламоній бромідом. в одному розчині отримують аденозін-трифосфат і дезоксі-аденозін-трифосфат. У цьому ж синтезі можна використовувати циклосаліцильний захист і похідні три валетного фосфору.
Профосфорювавши 5-3 положення дезоксирибонуклеозиду, ацетильний захист положення трештик необхідний. Далі, знявши захист і провівши взаємодію із похідною тетрабутиламонійною похідною пірофосфорної кислоти в ДМФА. отримують такий цикл трифосфат, який далі... Йодом окиснюють, тривалентний фосфор у ньому окислюють і розщеплюють аміаком.
Отримують сільовий трифосфат. Ще один синтез трифосфату, доклизить трифосфату, показано в даному разі на слайді. Це твердофасний метод синтезу, де на першій стадії готують місце...
приєднання похідної тривалентного фосфору, фактично циклосаліцильний захист, приєднують до лінкера. Ну а далі активують, діючи ПЕХОР-3, утворюють активну сполуку фосфора, яка і фосфорилює певний нуклеозид. певний нуклеозит. Що тут ще про що...
Після взаємодії діють похідною розчиною в органічних, розчинника похідною. пірофосфорної кислоти і отримують трифосфат, що містить один тривалентний атом фосфору. Його киснюють йодом і отримують сільову сполуку після гідролізу.
Аналогічно поступають у твердофазному синтезі. Коли через три-штрих положення циклофосфорильовану по хіду нуклеозиду гідролізують і знімають із носія. Ось такі от схеми синтезу.
Тепер перейдемо до олігонуклеотидів. Синтез олігонуклеотидів зараз є. надзвичайно популярним внаслідок того, що він є більш ефективним, ніж синтез відповідних пептидів.
Тобто ген певного пептиду синтезувати легше, ніж сам пептид. Твердофазний синтез розроблений зараз. Методи твертофазного синтезу олігоноклодотидів дозволяють створити олігоноклодотиди довжиною до 200 і більше залишків. Більшу кількість залишків заважає лише накопичення кількості помилок. При синтезі помилки трапляються завжди, як є пропуски, зокрема, це найбільша біда у всіх таких твердофазних синтезах і пептидів, і олігонуклеотидів.
Ну, а ще є синтез модифікованих нуклеозидів, з деякими з них ви, мабуть, вже знайомі, наприклад, Протеїн-нуклеїнові кислоти і ліпід-нуклеїнові кислоти тощо. Твердофазний синтез він... Має переваги перед синтезом урощена ті, що тут полегшується виділення і очистка кінцевого продукту. Не треба на кожній стадії проводити хроматографію, а можна лише один раз провести хроматографію в кінці синтезу, провести хроматографічну очистку. Наслідок простоти синтезу коротких нуклеотидів.
15-20 нуклеїнових основ. Стало популярний особливий прийом у молекулярній біології і в біохімії взагалі це застосування флуоресентних молекулярних біконів. Бікони це ліхтарики.
Про їх роботу ви можете почитати або в Вікіпедії, або, наприклад, у моєму посібнику з флуоресентної спектроскопії. Одним із популярних перших ефективних методів синтезу олігонукулетидів був аж фосфонатний метод, який показаний в даному разі на даному слайді. У ньому два дезокси рибоза захищені в положенні 5-3.
фосфорилюється по положенню 3. Далі ця сполука активується, перетворюється в хлоропохідну, і внаслідок чого можна далі провести конденсацію з наступним нуклеотидом. які приєднуються поводженням 5-3. Реагенти вказані тут на слайді, сполуки, які застосовуються, вказані на слайді.
Після проведення даної стадії треба зняти захист з... Положення три штрихи і можна далі проводити синтез. Якщо замісник R це тверда фаза, тоді це буде твердофазний аж фосфонатний синтез.
Ну, довго аж фосфонатний синтез не був популярним, довго не був популярним, швидко був заміщений, тому що він має свої недоліки. І досить швидко були розроблені більш досконалі методи, такі як фосфорамідідний метод синтезу. Але спочатку я вам продемонструю схему твердофазного ажфосфонатного методу. синтезу, у якому на 5 штрих ставиться диметокситретильний захист, 3 штрих гідроксильною групою закріплюється перший нуклеозит до твердої фази, далі знімає диметокситретильний захист. І можна вводити у взаємодію аж фосфонатну похідну наступного нуклеозида.
Після конденсації окиснюють аж фосфонатну похідну, наприклад, йодом, чи як на попередньому слайді було показано. Н-хлорсукцинемідом, і дінуклеотид вже готовий. А далі можна в цикл, далі сформувати цикл, знову зняти деметокситретильний захист і таким чином, крок за кроком, створити нуклеотид. певної довжини. Ну, а модифікації різних ажфосфонатів, різні модифікації ажфосфонатного методу показані тут на слайді.
Фосфодіестерний метод полягає у отриманні у застосуванні третильного захисту на 5,3-гідроксил. а конденсацію проводить, використовуючи 5 штрих монофосфат наступної нуклеїнової основи, застосовуючи дециклогексил карбодіамід або 4-тулулсульфанілхлорид. Утворюється такий от...
динуклеотид, і після зняття тритильного захисту можна продовжувати синтез, пришивати наступну нуклеїнову основу. Або ж після зняття ацетильного захисту можна пришивати наступну нуклеїнову основу. Більш ефективним... є фосфотриестерний метод синтезу, у якому диметокситритильний захист встановлюється на 5 штрих гідроксил першого нуклеозиду.
Захист використовують ціаноетильний у фосфаті, що встановлений на... три штрих положення. Дією три запропіл сілілклорида проводять конденсацію і отримують продукт реакції. Ну, після чого Після чого треба зняти захист і продовжувати синтез.
І можна продовжувати синтез. Далі синтез нуклеотидів був вдосконалений використанням фосфіто-триастерного методу синтезу, який полягає Ну і цілий ряд іще вдосконалень було зроблено. Фосфітотриестерний метод це застосування солей тривалентного фосфору, які були значно активніші, ніж похідні п'ятивалентного фосфору у фосфо-триестерному методі синтезу. Проте його швидко замінив. Фосфорамедітний метод, який фактично став найбільш досконалим, і його модифікації досі використовуються у синтезі олігонуклеотидів.
У цьому методі диметоксі третильний захист встановлюється на 5,3 гідроксил першого нуклеотиду. позиції 3 якого, 3 штрих якого, якраз і є фосфорамедітна, встановлюють фосфорамедітну групу шляхом фосфорлювання. Нагадаю, що в даному разі в нас ціаноетильний захист стоїть і активація відбувається в амідітах дізопропіламідною групою.
От така початкова. І саме з цією сполукою взаємодіє наступний нуклеотид. Тут справа показана, який захист треба використовувати для кожної з нуклеїнових основ.
Як бачите, уроцил не захищається без захисту, цитозін ацелюється, аденозін бензоілюється. і гонозин теж ацелюється альфа-метилпропіоновою кислотою. Фосфорамідітний захист має свої переваги, але має свої недоволіки.
Ну і перший, саме головний. Недолік це те, що треба проводити під аргоном, без доступу кисню. Дуже старано захищати реакційну масу від кисню, щоб не було окиснення. Як проводять синтез рибонуклеотидів, показано тут. використовуючи трет бутил сілінний захист або інші типи сілінного захисту в положенні 2 штрих рибози.
Ну і схема твердофазного синтезу на даному слайді. синтезі все організовано в цикл, приєднують перший нуклеотид через три штрих положення, на ньому в цей момент стоїть діметоксід витильний захист, далі знімають його в слабокислих умовах і створюють можливість для приєднання наступного. фосфоромедітної похідної і наступного нуклеотиду. Отримані сполуці знову знімають лимитокситритильний захист, лишаючи ціаноетильний захист. Отримують вже активовану похідну.
Перепрошую, спочатку окиснюють, пасивують, окиснюючи до фосфору патівалентного стану, і лише після цього знімає диметоксит ретильний захист, і можна чіпляти наступний нуклеотид. Тут детальніше описано процедуру. твердофазного синтезу фосфоромігітним методом.
Прочитайте, знайомитеся з нею самостійно, з цим текстом. Застосування кепінгу при синтезі довгих, великих за розміром нуклетидів необхідне. Оцтовий ангідрид для кепінгу застосовується. як і в випадку синтезу пептидів.
Ну і в даному разі остовен гідрид, він що? Ацелює 5-4 гідроксигрупи тих залишків, які не вступили в реакцію конденсації із черговим нуклеотидом. Саме кепінг і дозволяє позбавитися від пропусків, і цим полегшує очистку. кінцевого продукту, який проводять методом гель-електрофорезу.
Отака моя сьогоднішня лекція була, трошки коротша, ніж завжди. І я вам дякую за увагу.