Gene Cloning Process in DNA Technology

So in this video, we will discuss the application of recombinant DNA technology. So salah satu aplikasi untuk recombinant DNA technology adalah in gene cloning. So first, what is gene cloning? gene cloning. Apakah maksud gene cloning? So, gene cloning maksudnya adalah production of many copies of the target DNA. So, whatever target DNA ataupun Walaupun gen of interest yang kita ada. So dalam gene cloning kita nak buat banyak copies. Exact copies of that particular gene. So in this case the gene cloning process is done by using recombinant DNA technology. So generally ada dua jenis gene cloning process. Sama ada secara in vivo ataupun in vitro. So, in vivo bermaksud kita buat proses gene cloning involving living organism. Kalau in vitro pula, maksudnya gene cloning tersebut kita akan buat di dalam test tube, inside test tube iaitu outside living organism. So, for in vitro gene cloning, example adalah seperti PCR. Polymerase Chain Reaction So itu an example of Proses gene cloning Tapi berlaku secara in vitro Di dalam test tube Which does not involve living organism Okay So kalau in vivo gene cloning So, itu melibatkan living organism. Usually, kita akan guna bacteria. So, for in vivo gene cloning, kita akan guna bacteria as the host cell. Sebagai tempat untuk buat gene cloning. Iaitu untuk make many copies of the same target DNA. So, dalam selipasawa, kita hanya perlu discuss untuk in vivo gene cloning sahaja. So, in vitro tak dalam CS. So, saya tak akan discuss in vitro. PCR tu kita tak discuss. So, kita discuss in vitro. geng cloning dalam hidup menggunakan bakteria sebagai sel utama. Seterusnya kita tengok langkah dalam geng cloning menggunakan teknologi DNA yang berkombinasi. Jadi ada lima langkah dalam geng cloning. Jadi pertama adalah isolasi, kedua adalah klip atau potongan, ketiga adalah pembentukan, keempat adalah pembentukan dan kelima adalah pembentukan. Jadi ada lima langkah dalam geng cloning menggunakan teknologi DNA yang berkombinasi. Ok sekarang kita tengok step-step untuk gene cloning. So the first one is isolation. So ada dua benda yang kita nak isolate, kita nak remove from the original cell. Iaitu yang pertama kita nak remove target DNA. Second kita nak remove dia punya cloning vector which is the plasmid. So yang awak belajar cumalah plasmid sebagai cloning vector. So the other 3 example of cloning vector tu kamu hafal sahaja sebagai example yang lain. Tapi yang kita tengok in detail hanyalah plasmid dalam proses in vivo gene cloning. So ada 2 benda yang awak kena remove. Which is the target DNA and the DNA cloning vector from the original cell. So since ada 2 benda yang kita kena remove maksudnya ada 2 different original cell. So, sel yang pertama adalah bacteria cell. So, bacteria ni yang kita akan ambil dia punya plasmid. So, ingat plasmid can only be found inside bacteria. So, untuk isolation yang pertama kita akan isolate. Kita akan remove plasmid from the original cell which is the bacteria cell. So, yang kita nak keluarkan cuma plasmid sahaja. Kita tak nak dia punya nucleotides. atau kromosom dalam bakteria tersebut. Kita tak nak yang ni. Yang kita nak cumalah dia punya plasmid. So, first step is to remove the plasmid from the bacteria. So, sekarang plasmid tu sudah berada di luar bakteria cell. So, itu first half of isolation. So, next is to isolate the target DNA. So, untuk isolate target DNA, kita kena ambil DNA tersebut daripada sel asal dia. Contohnya, kalau target DNA yang kita nak clone adalah gen untuk eye color. Jadi, di dalam kromosom sel manusia, kita akan jumpa eye color gen. Katakan eye color gen itu berada di sini. Tetapi, masa isolation, kita tak boleh keluarkan eye color gen. Itu sahaja. Sebab eye color gene tu adalah sebahagian daripada the whole chromosome yang ada dalam nucleus. So, during isolation, kita akan remove the whole chromosome out of the nucleus including eye color punya gene. Which is the gene of interest. So, after isolation, kita akan dapat plasmid. dan juga human chromosome that contain the gene of interest ataupun target TNA. So itu adalah isolation. Okay next, second step is cleave or cut. So basically untuk potong. So apa yang kita nak cliff or cut adalah 2 DNA tadi. Which is kita nak cut plasmid dan juga kita nak cut target DNA. So during cliff and cut process, so both plasmid and the target DNA will be cut or will be cliff by using the same restriction enzyme. So ingat balik apakah itu restriction enzyme? Jadi, ia adalah enzim yang dapat mengenali DNA pada sebuah keadaan yang spesifik yang bernama situs restriksi dan kemudian memotong DNA. Jadi, itu adalah enzim restriksi. Jadi, dalam kes ini, pada tahap 2, sekaligus plasmid dan DNA yang ditarik, kita akan memotong, memotong, tetapi dengan menggunakan enzim restriksi yang sama. Okey, pertama kita fokus dekat cutting process dekat plasmid. So ingat sebelum ni, plasmid mengandungi MCS or Multiple Cloning Site. So semua plasmid ataupun DNA cloning vector mesti ada Multiple Cloning Site MCS. Sebab apa? Sebab multiple cloning site MCS. Multiple calling site sahaja the only part of the plasmid will contain yang akan mengandungi restriction site. So ingat tadi restriction site adalah tempat di mana restriction enzyme akan. akan recognize dan potong di situ. Okay, so in this case, inside the plasmid, the restriction site can be found di dalam multiple cloning site. So in this case, yang saya guna dalam example ni adalah GAA-TTC. So ingat balik, GAA-TTC adalah restriction site yang akan dikenal oleh enzim bernama ECO-R1. Maksudnya, untuk cut this particular plasmid, kita kena guna enzime EcoR1 sahaja. Sebab EcoR1 sahaja yang boleh kenal restriction site GAA TTC. So, once the enzyme EcoR1 recognize GAA TTC, so it will cut between G and A on both strands of the DNA. So lepas dia cut antara G dengan A on both strands of DNA, so enzime tu akan break all the hydrogen bonds between the complementary base pairing. So itulah yang dipanggil sebagai staggered cut. So Eco R1 akan produce staggered cut. Dekat mana? Dekat MCS. Yang kita jumpa dekat dalam plasmid. So since inside the plasmid, only the MCS. MCS sahaja yang contain target site ataupun restriction site. That's why Eco R1 tak akan potong dekat tempat lain, dekat plasmid tersebut. Dia hanya cut inside the MCS sahaja. So, itu... karakteristik yang penting untuk plasmid. So, during cleave and cut process, only the MCS will be cut by the restriction enzyme. So, the other parts of the plasmid takkan kena potong sebab dia tidak mengandungi restriction site untuk restriction enzyme potong. So, once Eco R1 cut the plasmid inside the MCS, so sekarang MCS tu sudah terbahagi dua, split into two. So kesannya plasmid itu sudah open, sudah terbuka. So itu clip cut untuk plasmid. Next, clip cut untuk target DNA. So kat sini kita nampak kita punya target DNA berada di tengah. Tengah-tengah 2 restriction site. So ada restriction site sebelah kiri. Satu lagi di sebelah kanan kita punya target DNA. So target DNA tu tadi eye color gene lah yang kita nak kan. So kat sini kita nampak dia punya restriction site adalah GATTTC. So GATTTC pun target site untuk ECO R1. So apa Eco R1 buat adalah kalau dia nampak sahaja restriction site dia akan pergi potong di antara G dan juga A. So tak kisahlah ada berapa site asalkan nampak ada restriction site yang dia kenal dia akan pergi situ dan akan pergi potong antara G dan juga A and produce staggered cut. So since ada 2 restriction site so enzyme tu akan potong dekat 2 tempat. Sebelah kiri dan juga sebelah kanan target DNA. So after the enzyme, ECO R1 cut the target DNA at two side. So sekarang kita akan dapat many DNA fragment. Dan salah satu DNA fragment tu akan mengandungi target DNA. So ini adalah cliff or cut step in gene cloning. Step 3, insertion. So insertion. basically kita nak insert the target DNA into the multiple cloning site of the plasmid so itu adalah insertion kita nak masukkan target DNA yang kita sudah cut daripada kromosom tadi dan kita masukkan ke dalam plasmid dekat mana dekat plasmid dekat multiple cloning site kenapa mesti dekat multiple cloning site sebab dekat situlah tempat yang enzim ECO-R1 sudah potong tadi. Dan bila potong guna the same enzim yang kita nampak sekarang, both target DNA dan juga the multiple coding site ada the same type of N. Ujung dia sama iaitu sticky N. Dan kita nampak dua-dua sticky N ni adalah complementary with each other. So, itu reason kenapa dalam step no. 2 tadi kita mesti potong target DNA dan plasmid using the same restriction enzyme supaya both of the fragment of DNA tu akan ada complementary end so bila dia complementary so insertion tu akan jadi senang so sekarang kita nampak Akan ada complementary base pairing antara sticky end of the target DNA dengan sticky end of the MCS. So for that reason, that's why target DNA boleh masuk ke dalam MCS. So at this point, target DNA technically sudah masuk ke dalam plasmid. Sebab tu namanya adalah insertion. So to insert the target DNA inside the plasmid. Dekat mana dekat plasmid? Dekat multiple cloning site of the plasmid. Okay the last step in insertion adalah an enzyme iaitu DNA ligase akan datang. Dan akan form phosphodiester bond antara target DNA dan juga antara multiple cloning site of the plasmid. So dekat sini tadi belum ada lagi phosphodiester bond. So DNA ligase akan form the bond between the backbone of the target DNA dan juga backbone of the plasmid. So lepas phosphodiester bond form, so target DNA tu sudah kena lock ke dalam plasmid. So dia tak boleh keluar balik daripada plasmid. So barulah complete process insertion. So this is the final product of insertion. So kita dapat plasmid Dan dalam plasmid tu ada MCS Dan dalam MCS kita akan jumpa target DNA sudah inserted in the middle of the MCS So at this point kita sudah berjaya create recombinant DNA so this whole thing now is known as recombinant DNA ataupun recombinant plasmid sebab apa recombinant? sebab ingat balik definition of recombinant DNA iaitu DNA yang contain segment from different resources ataupun from different organism so in this case kita punya plasmid datang daripada bakteria tapi target DNA kita tadi datang daripada human DNA so 2 different organism dan dua different sources. So at this point, kita dah berjaya create recombinant DNA dengan menggunakan recombinant DNA technology. So transformation basically we want to transfer the recombinant DNA into the host cell. So since recombinant DNA tadi adalah sebahagian daripada plasmid, so plasmid hanya boleh letak dalam bakteria. So that's why in this case, host cell kita adalah bacterial cell. So, during transformation, kita ambil recombinant DNA, kita akan masukkan ke dalam host cell iaitu bakteria. So, once the recombinant plasmid ataupun recombinant DNA has entered the host cell, recombinant plasmid tersebut akan undergo process DNA replication. So, daripada satu yang kita insert, after the recombinant plasmid undergo DNA replication, So, kita akan dapat banyak, many copies of the same recombinant plasmid. yang berada di dalam host cell. So sekarang, each of the host cell akan ada multiple copies of the recombinant DNA tadi sebab plasmid itu sudah undergo DNA replication. So, ingat balik kenapa plasmid boleh undergo DNA replication adalah sebab dia ada origin sendiri. So, itu adalah salah satu karakter yang penting untuk plasmid. Kenapa plasmid boleh jadi chloroform. Dia mesti ada MCS, dia mesti ada origin. So oleh kerana plasmid itu ada origin sendiri, so plasmid itu boleh buat replication sendiri independent of the host. So at this point host itu belum buat DNA replication tapi plasmid itu boleh buat replication sendiri sebab itu kita dapat many copies of the recombinant DNA dan recombinant DNA itu sendiri setiap satu akan mengandungi different copies of target DNA So sekarang kita sudah ada banyak recombinant DNA yang Ada target DNA Because of DNA replication Next, at the same time When the bacteria undergo binary fission So binary fission ni basically Cell tu buat mitosis Daripada satu cell akan jadi many host cell So kita akan dapat Many host cell And each host cell Has many copies of the recombinant plasmid That contain the target DNA So selepas binary fission completed, host cell tadi sudah undergo binary fission so kita akan dapat banyak lagi host cell dan setiap host cell itu akan mengandungi recombinant plasmid tadi. So, both of these process, DNA replication dan juga binary fusion akan berlaku semasa transformation process tadi. So, this particular section kita panggil sebagai amplification. So, number 1 and number 2 ni bernama amplification. Iaitu to amplify. Amplify maksudnya to increase in number. So apa yang kita nak increase in number? Ada dua benda. First, recombinant plasmid increase in number by DNA replication. Second, host cell pun akan increase in number by binary fission. So ada dua step in amplification. So amplification adalah sebahagian daripada proses transformation. That's why sometimes step 4 kita akan panggil sebagai transformation and amplification. Sebab amplification itu memang akan berlaku selepas transformation itu berlaku. Selepas recombinant DNA masuk ke dalam host cell. So dia automatic. So itu adalah step number 4 transformation and amplification. The last step in gene cloning using recombinant DNA technology is screening. Screening adalah kita ingin mencari host cell yang mengandungi plasmid dan dalam plasmid tersebut mengandungi target DNA. Ada dua benda yang kita nak cari. Kita nak cari host cell dan host cell itu mengandungi plasmid dan plasmid itu mengandungi target DNA. Itu yang kita nak cari dalam proses screening. So sebenarnya, semasa step 1 sampai step 4 tadi, kita bukan dapat host cell yang mengandungi plasmid yang dalam plasmid itu ada target DNA sahaja. So bukan yang ni sahaja yang kita dapat. Semasa step 1 until step 4, kita akan dapat sel-sel lain. For example, yang ni iaitu host cell tapi tidak undergo transformation. So kalau dia tak undergo transformation, so dia tak ada plasmid. So maksudnya transformation process untuk sel ini tidak berjaya. So the product is host cell tapi without plasmid. So itu first possibility. So another possibility. adalah this cell iaitu dia berjaya undergo transformation. Tetapi kalau awak tengok dekat dia punya plasmid plasmid dia tak ada target DNA. So maksudnya insertion ataupun cliff cut process untuk plasmid tersebut Tidak berjaya. Okay. So, no target DNA. So, generally ada 3 possibility daripada step 1 until step 4. Okay. So, yang kita nak adalah yang ini. Okay. So, that's why kita perlukan proses screening. Sebab screening akan tolong kita... pilih sel-sel yang kita nak dan remove sel-sel yang kita tak nak. So, untuk screening, an example of screening process yang awak kena boleh explain adalah blue-white screening. Okay, so blue-white screening adalah an example of process untuk screening, untuk step number 5. So, saya akan explain screening tapi in terms of blue-white screening process. So untuk understand blue-white screening process, kita kena tengok balik component of the plasmid. So sekarang kita back up sikit, kita tengok balik component of plasmid. Baru kita boleh faham apa yang berlaku semasa blue-white screening. So plasmid mesti ada 3 main components. So pertama dia mesti ada ori sequence. So tadi kita nampak ada ori sekuens penting supaya plasmid boleh buat replication sendiri independent of the host DNA. So itu ori. Second component yang kita perlukan adalah MCS. So yang color hitam ni adalah MCS. So MCS yang akan mengandungi restriction site yang akan dipotong oleh restriction enzyme. So, bila MCS dipotong oleh restriction enzyme, barulah target DNA boleh inserted in the middle of the MCS. So, itu komponen yang kedua. Komponen yang ketiga, so ni yang penting untuk screening iaitu selectable marker. So untuk plasmid, selectable marker in this case ada dua. First is like that gene. So ada gene like that. Second another. the gene is antibiotic resistant gene. For example, ampicillin resistant gene. So, untuk plasmid ni ada dua set table marker yang kita letak. First is like Z gene, second is antibiotic resistant gene iaitu ampicillin resistant gene. Ok, so first saya tengok Lexed dahulu. So, Lexed adalah jin yang akan produce beta galactosidase enzyme. So, kalau kamu nampak dalam plasmid ini, Lexed, dia ada dua part. Sebelum dengan selepas MCS. So, jin untuk lexed, dia sudah terbahagi dua. First part sebelum MCS, second part selepas MCS. So, ada dua part of the lexed. Dan lexed jin akan produce enzim beta-galactosidase. So, what does this enzyme do? So, enzim beta-galactosidase akan hydrolyze satu kompaun. perwarna yang bernama X-Gel. So, ada satu perwarna yang bernama X-Gel. So, X-Gel ini akan dihidrolize oleh enzim beta-galactosidase dan akan form X dan juga galactose. So, X dan galactose adalah produk apabila beta-galactosidase enzim potong kompaun X-Gel. So, bila X sudah kena release daripada galactose, sudah terpisah, Kesannya X itu adalah berwarna biru. Bila beta-gratocidase hajolah X-gal, environment di sekeliling akan menjadi berwarna biru sebab X itu sudah kena rilis daripada galaktos. Dalam bentuk X-gal, warna dia masih lagi warna putih. Apabila X itu sudah kena rilis daripada galaktos, barulah warna biru itu akan keluar daripada X-gal. Dan menyebabkan semua environment itu akan jadi warna biru. So, itu function selectable marker like Z di dalam plasmid. Second, kita tengok function of ampicillin resistant gene. AMPR gene iaitu sejenis antibiotic resistant gene. So, AMPR gene or any antibiotic resistant gene will produce protein that will hydrolyze antibiotic. For example, in this case adalah Antibiotik Antibiotic ampicillin. So, kalau plasmid itu ada antibiotic resistant gene, so plasmid itu akan produce satu protein di mana protein tersebut akan break down any antibiotic. So in this case antibiotic tersebut adalah ampicillin antibiotic So maksudnya kalau bakteria mengandungi plasmid dan plasmid itu mengandungi antibiotic resistant gene So, bakteria tersebut boleh hidup dalam environment yang ada antibiotik. Maksudnya, bakteria itu tidak akan dibunuh oleh antibiotik. Sepatutnya, bakteria kita akan bunuh menggunakan antibiotik. Tetapi, kalau bakteria itu ada jin di dalam plasmid dia dan jin tersebut adalah antibiotic resistant jin so, bakteria tersebut tidak akan mati. Sebab, bakteria... tersebut boleh produce protein dan protein itu yang akan hydrolyze antibiotic so maksudnya antibiotic itu sudah tak ada, sudah kena broken down by the protein produced by the antibiotic resistant gene so itu adalah function second set of marker which is antibiotic resistant gene, in this case saya guna ampicillin resistant gene so for this particular plasmid yang Iaitu plasmid yang ada lexat dan ada AMPR gene. So, bakteria yang mengandungi plasmid ini boleh hidup dalam environment yang ada antibiotik. Sebab dia ada AMPR gene. Itu yang pertama. Yang kedua, at the same time, so bakteria ini akan jadi warna biru. Sebab dalam dia punya plasmid ada lexat. Dan lexat tersebut. akan memproduksi beta-galactosidase dan beta-galactosidase akan menghidrolisasi X-gal. Jadi X-gal akan menjadi X dan gal. Jadi X akan memproduksi warna biru. Jadi seterusnya, jika DNA target telah diinsertasi ke dalam MCS plasmid, jadi dalam kes ini, apa yang akan berlaku adalah DNA target akan mengganggu. Seperti Z. Gene. Okay, since target DNA berada di tengah-tengah MCS, so target DNA tu akan kacau, disrupt like that punya gene. So, when the like that gene is disrupted, so it will cause the like that gene to become non-functional. Jadi ketika lexedzin tidak lagi berfungsi, lexedzin tidak dapat menghasilkan enzim beta-galactosidase. So, maksudnya, kalau ada target, enzim beta-galactosidase tak ada. So, kenapa enzim tu tak ada? Sebab target DNA itu sudah disrupt like that gene yang sepatutnya produce the enzyme. So, consequently, since tak ada beta-galactosidase, so there is no enzyme to hydrolyze X-gal. So, kalau tak ada enzim untuk breakdown X-gal, so tak ada X. So, So, kalau tak ada X, tak adalah blue color tersebut. So, kalau tak ada blue color, so basically dia akan remain white ataupun colorless in color. So, dua benda ni kena ingat. So, first tadi, tak ada target, ada like Z. Second ini, ada target, tak ada like Z. Maksudnya non-functional. Like Z dia become non-functional. So, next, during screening, apa yang kita akan buat? buat adalah kita ambil bakteria tadi dan kita letak dalam petri dish dan dalam petri dish itu akan ada medium untuk bakteria itu grow tapi medium itu kita letak X-Gel dan juga ampicillin antibiotik so ada dua ada dua benda yang kita letak dalam petri dish tersebut X-Gel dan juga ampicillin so hasilnya after a few days so akan ada dua jenis koloni yang kita akan nampak growing inside the petri dish so the first one is blue colony the second one is white colony so sekarang out of these two different bacterial colony, so kita nak pilih yang mana so that's why nama proses tadi adalah blue white screening screening pilih, pilih yang mana blue ke nak white Okay, so untuk decide mana satu yang kita nak, that's why tadi kita tengok balik yang plus mid. Based on plasmid tadi, kita tahu kalau dia blue color ni, maksudnya dia adalah host cell yang sudah ada plasmid tetapi plasmid itu tak ada target DNA. So, itu adalah blue color. koloni punya bakteria bakteria host cell yang sudah mengandungi plasmid tetapi plasmid tersebut tidak ada target DNA di dalamnya so kita tak nak blue koloni sebab yang kita nak adalah Adalah host cell yang mengandungi plasmid dan dalam plasmid tu ada target. So blue kita tak nak sebab dia tak ada target. Tetapi untuk white colony. So white colony kenapa dia white? Sebab dia tak ada X. X tu tidak hydrolyze. Kenapa X tu tidak hydrolyze? Sebab tak ada beta galactosidase enzyme. So kenapa tak ada beta galactosidase enzyme? Sebab lexed gene sudah. become non-functional so kenapa lexed gene sudah become non-functional sebab lexed gene itu sudah disrupted by target DNA so that's why kita pilih white colony sebab white colony yang ada target DNA yang kita sudah clone tadi so inilah dia bakteria yang kita akan jumpa dekat dalam blue colony dan juga white colony so kita akan ambil semua baik Bacteria yang ada dekat dalam white colony. So, bacteria tersebut yang mengandungi target DNA yang kita nak. Untuk bacteria host cell yang tak ada plasmid. So, this bacteria cannot grow in the petri dish. So, that's why tadi ada dua koloni sahaja. Color biru dan juga color putih. Dan dua. dua mengandungi plasmid. Cuma kalau putih, plasmid itu ada target. Kalau biru, plasmid itu tak ada target. Okay? So, untuk mana-mana bakteria yang tak ada plasmid, the bacteria will die in the middle. Medium containing antibiotic. Because they are being killed by the antibiotic. Kenapa bakteria itu kena bunuh oleh antibiotic? Sebab bakteria itu tak ada plasmid. Ingat tadi plasmid akan mengandungi antibiotic resistant gene. So kalau bakteria ini tak ada antibiotic resistant gene yang ada dalam plasmid tersebut. So, bakteria itu akan mati so dia tak akan grow. So, tak akan wujud koloni untuk bakteria yang tak ada plasmid. Sebab semuanya kena bunuh oleh antibiotik. Okay, so that's why kita akan dapat dua koloni sahaja. Biru atau putih. Dan kita akan ambil yang putih. Sebab tu nama proses ni adalah blue-white screening.

So in this video, we will discuss the application of recombinant DNA technology. So salah satu aplikasi untuk recombinant DNA technology adalah in gene cloning. So first, what is gene cloning?

gene cloning. Apakah maksud gene cloning? So, gene cloning maksudnya adalah production of many copies of the target DNA. So, whatever target DNA ataupun Walaupun gen of interest yang kita ada. So dalam gene cloning kita nak buat banyak copies.

Exact copies of that particular gene. So in this case the gene cloning process is done by using recombinant DNA technology. So generally ada dua jenis gene cloning process. Sama ada secara in vivo ataupun in vitro. So, in vivo bermaksud kita buat proses gene cloning involving living organism.

Kalau in vitro pula, maksudnya gene cloning tersebut kita akan buat di dalam test tube, inside test tube iaitu outside living organism. So, for in vitro gene cloning, example adalah seperti PCR. Polymerase Chain Reaction So itu an example of Proses gene cloning Tapi berlaku secara in vitro Di dalam test tube Which does not involve living organism Okay So kalau in vivo gene cloning So, itu melibatkan living organism.

Usually, kita akan guna bacteria. So, for in vivo gene cloning, kita akan guna bacteria as the host cell. Sebagai tempat untuk buat gene cloning.

Iaitu untuk make many copies of the same target DNA. So, dalam selipasawa, kita hanya perlu discuss untuk in vivo gene cloning sahaja. So, in vitro tak dalam CS. So, saya tak akan discuss in vitro.

PCR tu kita tak discuss. So, kita discuss in vitro. geng cloning dalam hidup menggunakan bakteria sebagai sel utama.

Seterusnya kita tengok langkah dalam geng cloning menggunakan teknologi DNA yang berkombinasi. Jadi ada lima langkah dalam geng cloning. Jadi pertama adalah isolasi, kedua adalah klip atau potongan, ketiga adalah pembentukan, keempat adalah pembentukan dan kelima adalah pembentukan. Jadi ada lima langkah dalam geng cloning menggunakan teknologi DNA yang berkombinasi.

Ok sekarang kita tengok step-step untuk gene cloning. So the first one is isolation. So ada dua benda yang kita nak isolate, kita nak remove from the original cell.

Iaitu yang pertama kita nak remove target DNA. Second kita nak remove dia punya cloning vector which is the plasmid. So yang awak belajar cumalah plasmid sebagai cloning vector. So the other 3 example of cloning vector tu kamu hafal sahaja sebagai example yang lain.

Tapi yang kita tengok in detail hanyalah plasmid dalam proses in vivo gene cloning. So ada 2 benda yang awak kena remove. Which is the target DNA and the DNA cloning vector from the original cell. So since ada 2 benda yang kita kena remove maksudnya ada 2 different original cell. So, sel yang pertama adalah bacteria cell.

So, bacteria ni yang kita akan ambil dia punya plasmid. So, ingat plasmid can only be found inside bacteria. So, untuk isolation yang pertama kita akan isolate.

Kita akan remove plasmid from the original cell which is the bacteria cell. So, yang kita nak keluarkan cuma plasmid sahaja. Kita tak nak dia punya nucleotides.

atau kromosom dalam bakteria tersebut. Kita tak nak yang ni. Yang kita nak cumalah dia punya plasmid. So, first step is to remove the plasmid from the bacteria.

So, sekarang plasmid tu sudah berada di luar bakteria cell. So, itu first half of isolation. So, next is to isolate the target DNA.

So, untuk isolate target DNA, kita kena ambil DNA tersebut daripada sel asal dia. Contohnya, kalau target DNA yang kita nak clone adalah gen untuk eye color. Jadi, di dalam kromosom sel manusia, kita akan jumpa eye color gen. Katakan eye color gen itu berada di sini. Tetapi, masa isolation, kita tak boleh keluarkan eye color gen. Itu sahaja.

Sebab eye color gene tu adalah sebahagian daripada the whole chromosome yang ada dalam nucleus. So, during isolation, kita akan remove the whole chromosome out of the nucleus including eye color punya gene. Which is the gene of interest.

So, after isolation, kita akan dapat plasmid. dan juga human chromosome that contain the gene of interest ataupun target TNA. So itu adalah isolation. Okay next, second step is cleave or cut.

So basically untuk potong. So apa yang kita nak cliff or cut adalah 2 DNA tadi. Which is kita nak cut plasmid dan juga kita nak cut target DNA. So during cliff and cut process, so both plasmid and the target DNA will be cut or will be cliff by using the same restriction enzyme.

So ingat balik apakah itu restriction enzyme? Jadi, ia adalah enzim yang dapat mengenali DNA pada sebuah keadaan yang spesifik yang bernama situs restriksi dan kemudian memotong DNA. Jadi, itu adalah enzim restriksi. Jadi, dalam kes ini, pada tahap 2, sekaligus plasmid dan DNA yang ditarik, kita akan memotong, memotong, tetapi dengan menggunakan enzim restriksi yang sama.

Okey, pertama kita fokus dekat cutting process dekat plasmid. So ingat sebelum ni, plasmid mengandungi MCS or Multiple Cloning Site. So semua plasmid ataupun DNA cloning vector mesti ada Multiple Cloning Site MCS. Sebab apa?

Sebab multiple cloning site MCS. Multiple calling site sahaja the only part of the plasmid will contain yang akan mengandungi restriction site. So ingat tadi restriction site adalah tempat di mana restriction enzyme akan.

akan recognize dan potong di situ. Okay, so in this case, inside the plasmid, the restriction site can be found di dalam multiple cloning site. So in this case, yang saya guna dalam example ni adalah GAA-TTC.

So ingat balik, GAA-TTC adalah restriction site yang akan dikenal oleh enzim bernama ECO-R1. Maksudnya, untuk cut this particular plasmid, kita kena guna enzime EcoR1 sahaja. Sebab EcoR1 sahaja yang boleh kenal restriction site GAA TTC. So, once the enzyme EcoR1 recognize GAA TTC, so it will cut between G and A on both strands of the DNA. So lepas dia cut antara G dengan A on both strands of DNA, so enzime tu akan break all the hydrogen bonds between the complementary base pairing.

So itulah yang dipanggil sebagai staggered cut. So Eco R1 akan produce staggered cut. Dekat mana? Dekat MCS.

Yang kita jumpa dekat dalam plasmid. So since inside the plasmid, only the MCS. MCS sahaja yang contain target site ataupun restriction site. That's why Eco R1 tak akan potong dekat tempat lain, dekat plasmid tersebut. Dia hanya cut inside the MCS sahaja.

So, itu... karakteristik yang penting untuk plasmid. So, during cleave and cut process, only the MCS will be cut by the restriction enzyme.

So, the other parts of the plasmid takkan kena potong sebab dia tidak mengandungi restriction site untuk restriction enzyme potong. So, once Eco R1 cut the plasmid inside the MCS, so sekarang MCS tu sudah terbahagi dua, split into two. So kesannya plasmid itu sudah open, sudah terbuka. So itu clip cut untuk plasmid. Next, clip cut untuk target DNA.

So kat sini kita nampak kita punya target DNA berada di tengah. Tengah-tengah 2 restriction site. So ada restriction site sebelah kiri.

Satu lagi di sebelah kanan kita punya target DNA. So target DNA tu tadi eye color gene lah yang kita nak kan. So kat sini kita nampak dia punya restriction site adalah GATTTC.

So GATTTC pun target site untuk ECO R1. So apa Eco R1 buat adalah kalau dia nampak sahaja restriction site dia akan pergi potong di antara G dan juga A. So tak kisahlah ada berapa site asalkan nampak ada restriction site yang dia kenal dia akan pergi situ dan akan pergi potong antara G dan juga A and produce staggered cut.

So since ada 2 restriction site so enzyme tu akan potong dekat 2 tempat. Sebelah kiri dan juga sebelah kanan target DNA. So after the enzyme, ECO R1 cut the target DNA at two side.

So sekarang kita akan dapat many DNA fragment. Dan salah satu DNA fragment tu akan mengandungi target DNA. So ini adalah cliff or cut step in gene cloning.

Step 3, insertion. So insertion. basically kita nak insert the target DNA into the multiple cloning site of the plasmid so itu adalah insertion kita nak masukkan target DNA yang kita sudah cut daripada kromosom tadi dan kita masukkan ke dalam plasmid dekat mana dekat plasmid dekat multiple cloning site kenapa mesti dekat multiple cloning site sebab dekat situlah tempat yang enzim ECO-R1 sudah potong tadi.

Dan bila potong guna the same enzim yang kita nampak sekarang, both target DNA dan juga the multiple coding site ada the same type of N. Ujung dia sama iaitu sticky N. Dan kita nampak dua-dua sticky N ni adalah complementary with each other. So, itu reason kenapa dalam step no. 2 tadi kita mesti potong target DNA dan plasmid using the same restriction enzyme supaya both of the fragment of DNA tu akan ada complementary end so bila dia complementary so insertion tu akan jadi senang so sekarang kita nampak Akan ada complementary base pairing antara sticky end of the target DNA dengan sticky end of the MCS. So for that reason, that's why target DNA boleh masuk ke dalam MCS.

So at this point, target DNA technically sudah masuk ke dalam plasmid. Sebab tu namanya adalah insertion. So to insert the target DNA inside the plasmid.

Dekat mana dekat plasmid? Dekat multiple cloning site of the plasmid. Okay the last step in insertion adalah an enzyme iaitu DNA ligase akan datang.

Dan akan form phosphodiester bond antara target DNA dan juga antara multiple cloning site of the plasmid. So dekat sini tadi belum ada lagi phosphodiester bond. So DNA ligase akan form the bond between the backbone of the target DNA dan juga backbone of the plasmid. So lepas phosphodiester bond form, so target DNA tu sudah kena lock ke dalam plasmid. So dia tak boleh keluar balik daripada plasmid.

So barulah complete process insertion. So this is the final product of insertion. So kita dapat plasmid Dan dalam plasmid tu ada MCS Dan dalam MCS kita akan jumpa target DNA sudah inserted in the middle of the MCS So at this point kita sudah berjaya create recombinant DNA so this whole thing now is known as recombinant DNA ataupun recombinant plasmid sebab apa recombinant? sebab ingat balik definition of recombinant DNA iaitu DNA yang contain segment from different resources ataupun from different organism so in this case kita punya plasmid datang daripada bakteria tapi target DNA kita tadi datang daripada human DNA so 2 different organism dan dua different sources. So at this point, kita dah berjaya create recombinant DNA dengan menggunakan recombinant DNA technology.

So transformation basically we want to transfer the recombinant DNA into the host cell. So since recombinant DNA tadi adalah sebahagian daripada plasmid, so plasmid hanya boleh letak dalam bakteria. So that's why in this case, host cell kita adalah bacterial cell.

So, during transformation, kita ambil recombinant DNA, kita akan masukkan ke dalam host cell iaitu bakteria. So, once the recombinant plasmid ataupun recombinant DNA has entered the host cell, recombinant plasmid tersebut akan undergo process DNA replication. So, daripada satu yang kita insert, after the recombinant plasmid undergo DNA replication, So, kita akan dapat banyak, many copies of the same recombinant plasmid.

yang berada di dalam host cell. So sekarang, each of the host cell akan ada multiple copies of the recombinant DNA tadi sebab plasmid itu sudah undergo DNA replication. So, ingat balik kenapa plasmid boleh undergo DNA replication adalah sebab dia ada origin sendiri. So, itu adalah salah satu karakter yang penting untuk plasmid.

Kenapa plasmid boleh jadi chloroform. Dia mesti ada MCS, dia mesti ada origin. So oleh kerana plasmid itu ada origin sendiri, so plasmid itu boleh buat replication sendiri independent of the host. So at this point host itu belum buat DNA replication tapi plasmid itu boleh buat replication sendiri sebab itu kita dapat many copies of the recombinant DNA dan recombinant DNA itu sendiri setiap satu akan mengandungi different copies of target DNA So sekarang kita sudah ada banyak recombinant DNA yang Ada target DNA Because of DNA replication Next, at the same time When the bacteria undergo binary fission So binary fission ni basically Cell tu buat mitosis Daripada satu cell akan jadi many host cell So kita akan dapat Many host cell And each host cell Has many copies of the recombinant plasmid That contain the target DNA So selepas binary fission completed, host cell tadi sudah undergo binary fission so kita akan dapat banyak lagi host cell dan setiap host cell itu akan mengandungi recombinant plasmid tadi.

So, both of these process, DNA replication dan juga binary fusion akan berlaku semasa transformation process tadi. So, this particular section kita panggil sebagai amplification. So, number 1 and number 2 ni bernama amplification.

Iaitu to amplify. Amplify maksudnya to increase in number. So apa yang kita nak increase in number? Ada dua benda.

First, recombinant plasmid increase in number by DNA replication. Second, host cell pun akan increase in number by binary fission. So ada dua step in amplification. So amplification adalah sebahagian daripada proses transformation.

That's why sometimes step 4 kita akan panggil sebagai transformation and amplification. Sebab amplification itu memang akan berlaku selepas transformation itu berlaku. Selepas recombinant DNA masuk ke dalam host cell. So dia automatic. So itu adalah step number 4 transformation and amplification.

The last step in gene cloning using recombinant DNA technology is screening. Screening adalah kita ingin mencari host cell yang mengandungi plasmid dan dalam plasmid tersebut mengandungi target DNA. Ada dua benda yang kita nak cari. Kita nak cari host cell dan host cell itu mengandungi plasmid dan plasmid itu mengandungi target DNA. Itu yang kita nak cari dalam proses screening.

So sebenarnya, semasa step 1 sampai step 4 tadi, kita bukan dapat host cell yang mengandungi plasmid yang dalam plasmid itu ada target DNA sahaja. So bukan yang ni sahaja yang kita dapat. Semasa step 1 until step 4, kita akan dapat sel-sel lain.

For example, yang ni iaitu host cell tapi tidak undergo transformation. So kalau dia tak undergo transformation, so dia tak ada plasmid. So maksudnya transformation process untuk sel ini tidak berjaya. So the product is host cell tapi without plasmid.

So itu first possibility. So another possibility. adalah this cell iaitu dia berjaya undergo transformation.

Tetapi kalau awak tengok dekat dia punya plasmid plasmid dia tak ada target DNA. So maksudnya insertion ataupun cliff cut process untuk plasmid tersebut Tidak berjaya. Okay.

So, no target DNA. So, generally ada 3 possibility daripada step 1 until step 4. Okay. So, yang kita nak adalah yang ini.

Okay. So, that's why kita perlukan proses screening. Sebab screening akan tolong kita...

pilih sel-sel yang kita nak dan remove sel-sel yang kita tak nak. So, untuk screening, an example of screening process yang awak kena boleh explain adalah blue-white screening. Okay, so blue-white screening adalah an example of process untuk screening, untuk step number 5. So, saya akan explain screening tapi in terms of blue-white screening process. So untuk understand blue-white screening process, kita kena tengok balik component of the plasmid. So sekarang kita back up sikit, kita tengok balik component of plasmid.

Baru kita boleh faham apa yang berlaku semasa blue-white screening. So plasmid mesti ada 3 main components. So pertama dia mesti ada ori sequence. So tadi kita nampak ada ori sekuens penting supaya plasmid boleh buat replication sendiri independent of the host DNA. So itu ori.

Second component yang kita perlukan adalah MCS. So yang color hitam ni adalah MCS. So MCS yang akan mengandungi restriction site yang akan dipotong oleh restriction enzyme.

So, bila MCS dipotong oleh restriction enzyme, barulah target DNA boleh inserted in the middle of the MCS. So, itu komponen yang kedua. Komponen yang ketiga, so ni yang penting untuk screening iaitu selectable marker.

So untuk plasmid, selectable marker in this case ada dua. First is like that gene. So ada gene like that.

Second another. the gene is antibiotic resistant gene. For example, ampicillin resistant gene. So, untuk plasmid ni ada dua set table marker yang kita letak. First is like Z gene, second is antibiotic resistant gene iaitu ampicillin resistant gene.

Ok, so first saya tengok Lexed dahulu. So, Lexed adalah jin yang akan produce beta galactosidase enzyme. So, kalau kamu nampak dalam plasmid ini, Lexed, dia ada dua part.

Sebelum dengan selepas MCS. So, jin untuk lexed, dia sudah terbahagi dua. First part sebelum MCS, second part selepas MCS. So, ada dua part of the lexed. Dan lexed jin akan produce enzim beta-galactosidase.

So, what does this enzyme do? So, enzim beta-galactosidase akan hydrolyze satu kompaun. perwarna yang bernama X-Gel. So, ada satu perwarna yang bernama X-Gel.

So, X-Gel ini akan dihidrolize oleh enzim beta-galactosidase dan akan form X dan juga galactose. So, X dan galactose adalah produk apabila beta-galactosidase enzim potong kompaun X-Gel. So, bila X sudah kena release daripada galactose, sudah terpisah, Kesannya X itu adalah berwarna biru.

Bila beta-gratocidase hajolah X-gal, environment di sekeliling akan menjadi berwarna biru sebab X itu sudah kena rilis daripada galaktos. Dalam bentuk X-gal, warna dia masih lagi warna putih. Apabila X itu sudah kena rilis daripada galaktos, barulah warna biru itu akan keluar daripada X-gal. Dan menyebabkan semua environment itu akan jadi warna biru. So, itu function selectable marker like Z di dalam plasmid.

Second, kita tengok function of ampicillin resistant gene. AMPR gene iaitu sejenis antibiotic resistant gene. So, AMPR gene or any antibiotic resistant gene will produce protein that will hydrolyze antibiotic. For example, in this case adalah Antibiotik Antibiotic ampicillin.

So, kalau plasmid itu ada antibiotic resistant gene, so plasmid itu akan produce satu protein di mana protein tersebut akan break down any antibiotic. So in this case antibiotic tersebut adalah ampicillin antibiotic So maksudnya kalau bakteria mengandungi plasmid dan plasmid itu mengandungi antibiotic resistant gene So, bakteria tersebut boleh hidup dalam environment yang ada antibiotik. Maksudnya, bakteria itu tidak akan dibunuh oleh antibiotik.

Sepatutnya, bakteria kita akan bunuh menggunakan antibiotik. Tetapi, kalau bakteria itu ada jin di dalam plasmid dia dan jin tersebut adalah antibiotic resistant jin so, bakteria tersebut tidak akan mati. Sebab, bakteria... tersebut boleh produce protein dan protein itu yang akan hydrolyze antibiotic so maksudnya antibiotic itu sudah tak ada, sudah kena broken down by the protein produced by the antibiotic resistant gene so itu adalah function second set of marker which is antibiotic resistant gene, in this case saya guna ampicillin resistant gene so for this particular plasmid yang Iaitu plasmid yang ada lexat dan ada AMPR gene. So, bakteria yang mengandungi plasmid ini boleh hidup dalam environment yang ada antibiotik.

Sebab dia ada AMPR gene. Itu yang pertama. Yang kedua, at the same time, so bakteria ini akan jadi warna biru. Sebab dalam dia punya plasmid ada lexat. Dan lexat tersebut.

akan memproduksi beta-galactosidase dan beta-galactosidase akan menghidrolisasi X-gal. Jadi X-gal akan menjadi X dan gal. Jadi X akan memproduksi warna biru.

Jadi seterusnya, jika DNA target telah diinsertasi ke dalam MCS plasmid, jadi dalam kes ini, apa yang akan berlaku adalah DNA target akan mengganggu. Seperti Z. Gene. Okay, since target DNA berada di tengah-tengah MCS, so target DNA tu akan kacau, disrupt like that punya gene.

So, when the like that gene is disrupted, so it will cause the like that gene to become non-functional. Jadi ketika lexedzin tidak lagi berfungsi, lexedzin tidak dapat menghasilkan enzim beta-galactosidase. So, maksudnya, kalau ada target, enzim beta-galactosidase tak ada.

So, kenapa enzim tu tak ada? Sebab target DNA itu sudah disrupt like that gene yang sepatutnya produce the enzyme. So, consequently, since tak ada beta-galactosidase, so there is no enzyme to hydrolyze X-gal. So, kalau tak ada enzim untuk breakdown X-gal, so tak ada X. So, So, kalau tak ada X, tak adalah blue color tersebut.

So, kalau tak ada blue color, so basically dia akan remain white ataupun colorless in color. So, dua benda ni kena ingat. So, first tadi, tak ada target, ada like Z.

Second ini, ada target, tak ada like Z. Maksudnya non-functional. Like Z dia become non-functional. So, next, during screening, apa yang kita akan buat?

buat adalah kita ambil bakteria tadi dan kita letak dalam petri dish dan dalam petri dish itu akan ada medium untuk bakteria itu grow tapi medium itu kita letak X-Gel dan juga ampicillin antibiotik so ada dua ada dua benda yang kita letak dalam petri dish tersebut X-Gel dan juga ampicillin so hasilnya after a few days so akan ada dua jenis koloni yang kita akan nampak growing inside the petri dish so the first one is blue colony the second one is white colony so sekarang out of these two different bacterial colony, so kita nak pilih yang mana so that's why nama proses tadi adalah blue white screening screening pilih, pilih yang mana blue ke nak white Okay, so untuk decide mana satu yang kita nak, that's why tadi kita tengok balik yang plus mid. Based on plasmid tadi, kita tahu kalau dia blue color ni, maksudnya dia adalah host cell yang sudah ada plasmid tetapi plasmid itu tak ada target DNA. So, itu adalah blue color.

koloni punya bakteria bakteria host cell yang sudah mengandungi plasmid tetapi plasmid tersebut tidak ada target DNA di dalamnya so kita tak nak blue koloni sebab yang kita nak adalah Adalah host cell yang mengandungi plasmid dan dalam plasmid tu ada target. So blue kita tak nak sebab dia tak ada target. Tetapi untuk white colony. So white colony kenapa dia white? Sebab dia tak ada X.

X tu tidak hydrolyze. Kenapa X tu tidak hydrolyze? Sebab tak ada beta galactosidase enzyme.

So kenapa tak ada beta galactosidase enzyme? Sebab lexed gene sudah. become non-functional so kenapa lexed gene sudah become non-functional sebab lexed gene itu sudah disrupted by target DNA so that's why kita pilih white colony sebab white colony yang ada target DNA yang kita sudah clone tadi so inilah dia bakteria yang kita akan jumpa dekat dalam blue colony dan juga white colony so kita akan ambil semua baik Bacteria yang ada dekat dalam white colony.

So, bacteria tersebut yang mengandungi target DNA yang kita nak. Untuk bacteria host cell yang tak ada plasmid. So, this bacteria cannot grow in the petri dish.

So, that's why tadi ada dua koloni sahaja. Color biru dan juga color putih. Dan dua. dua mengandungi plasmid.

Cuma kalau putih, plasmid itu ada target. Kalau biru, plasmid itu tak ada target. Okay? So, untuk mana-mana bakteria yang tak ada plasmid, the bacteria will die in the middle. Medium containing antibiotic.

Because they are being killed by the antibiotic. Kenapa bakteria itu kena bunuh oleh antibiotic? Sebab bakteria itu tak ada plasmid.

Ingat tadi plasmid akan mengandungi antibiotic resistant gene. So kalau bakteria ini tak ada antibiotic resistant gene yang ada dalam plasmid tersebut. So, bakteria itu akan mati so dia tak akan grow. So, tak akan wujud koloni untuk bakteria yang tak ada plasmid. Sebab semuanya kena bunuh oleh antibiotik.

Okay, so that's why kita akan dapat dua koloni sahaja. Biru atau putih. Dan kita akan ambil yang putih.

Sebab tu nama proses ni adalah blue-white screening.

Transcript for:Gene Cloning Process in DNA Technology

Transcript for:
Gene Cloning Process in DNA Technology