PCR技术讲解

简介

• PCR全称为聚合酶链式反应，是一种用于扩增DNA片段的技术。
• 了解PCR的基本技术原理有助于更好地完成实验并获得目标片段。

PCR技术发明史

• 1971年：Kohorana提出了通过DNA变性、引物合成和DNA聚合酶延伸进行基因克隆的设想。
• 1985年：美国PE公司的Mulis正式发明了PCR技术。
• 1989年：PCR被《Science》杂志评为十项重大科学发明之一，Mulis因此获得诺贝尔化学奖。

PCR基本原理

1. 变性：加热至94摄氏度，使DNA双链解开形成单链。
2. 退火：降低温度至55-65摄氏度，引物与单链DNA结合。
3. 延伸：温度升高至72摄氏度，DNA聚合酶从引物的3'端开始合成新链。
4. 重复循环：一般进行20-30个循环，基因扩增到100万倍以上。

PCR的关键组分

• 高质量的DNA靶标片段
• 合适的引物
• DNTP（ATGC）
• 高质量的DNA聚合酶
• 商业化的MIX包含了除DNA模板和引物外的所有成分

标准的PCR反应体系

• 四种DNTP的混合物：200微摩尔每升
• 上下游引物：10到100皮摩尔
• 模板DNA：0.1到2微克
• DNA聚合酶：2.5国际单位
• 美离子：1.5毫摩尔每升
• 缓冲体系：不同目标使用不同体系，如氨根离子

常用DNA聚合酶

• TAC DNA聚合酶：来源于温泉菌，耐高温，最佳酶活性在72摄氏度。

PCR的变性、退火和延伸过程

• 变性：95摄氏度，DNA双链解开
• 退火：引物与解链后的DNA结合
• 延伸：72摄氏度，TAC DNA聚合酶合成新DNA链

PCR循环数与DNA片段数的关系

• 目标DNA片段数与循环数有关，通过公式2^n - 2n计算
• 30个循环可获得10亿个DNA目标片段，实验时间通常在4小时以内

PCR的应用

• 基因诊断
• 基因治疗
• 基因工程
• 法医学检验
• 人类学研究
• 动物学研究

总结

• PCR技术是现代生物学实验的基础技术之一。
• 了解其基本原理和组分有助于提高实验效率和结果的准确性。