Sanger Sequencing Overview

Overzicht

Deze les behandelt de Sanger-sequencingmethode, waarbij het principe, de klassieke aanpak en de ontwikkelingen in moderne Sanger-sequencing met fluorescente kleurstoffen worden uitgelegd.

Principe van Sanger-sequencing

Sanger-sequencing berust op keten-terminerende nucleotiden, genaamd dideoxynucleotiden (ddNTPs).
DNA-polymerase bouwt DNA op door deoxynucleotide-trifosfaten (dNTPs) toe te voegen in aanwezigheid van een 3’-OH groep.
Het ontbreken van de 3’-OH groep in ddNTPs voorkomt de toevoeging van verdere nucleotiden, waardoor de DNA-synthese stopt.

Klassieke Sanger-sequencingmethode

Het template-DNA wordt verdeeld over vier buisjes, elk met een primer en alle vier de dNTPs.
Elk buisje bevat een lage concentratie van één radioactief gelabeld ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP of ddCTP).
Inbouw van een ddNTP leidt tot willekeurige keten-terminatie, wat fragmenten van verschillende lengtes oplevert.
Fragmenten worden gescheiden door polyacrylamide-gel-elektroforese en zichtbaar gemaakt met autoradiografie.
De sequentie wordt bepaald door de fragmentlengtes te analyseren die overeenkomen met elk ddNTP-buisje.

Moderne Sanger-sequencingmethode

Elk ddNTP is gelabeld met een unieke fluorescente kleur (geel, groen, blauw of rood).
Alle reacties worden uitgevoerd in één buisje, omdat elke kleur de terminatiebase identificeert.
Keten-terminerende fragmenten worden gescheiden door gel- of capillaire elektroforese.
Fluorescente signalen worden gedetecteerd met apparaten zoals CCD-sensoren voor geautomatiseerde sequentie-uitlezing.

Belangrijke termen en definities

Nucleotide — een molecuul met een stikstofbase, suikergroep en fosfaatgroep.
Nucleoside — een molecuul met alleen een stikstofbase en suikergroep.
Deoxynucleotide (dNTP) — nucleotide zonder een 2’-OH groep, gebruikt door DNA-polymerase.
Dideoxynucleotide (ddNTP) — nucleotide zonder zowel 2’- als 3’-OH groepen, gebruikt om DNA-synthese te beëindigen.
DNA-polymerase — enzym dat DNA synthetiseert door dNTPs toe te voegen aan een groeiende streng.
Polyacrylamide-gel-elektroforese — techniek om DNA-fragmenten te scheiden op grootte.
Autoradiografie — methode om radioactief gelabelde moleculen op een gel zichtbaar te maken.
Capillaire elektroforese — geautomatiseerde techniek voor het scheiden van DNA-fragmenten in moderne sequencing.

1. Basisprincipe van Sanger sequencing

Sanger sequencing berust op het gebruik van dideoxynucleotiden (ddNTPs) die ontbreken aan de 3’-OH groep op het suikerdeel van het nucleotide. Dit is cruciaal omdat DNA-polymerase tijdens DNA-synthese een nieuwe nucleotide toevoegt door een binding te vormen tussen de 3’-OH groep van het laatste nucleotide in de keten en de 5’-fosfaatgroep van het nieuwe nucleotide.

Normale nucleotiden (dNTPs) hebben een 3’-OH groep, waardoor DNA-polymerase de keten kan verlengen.
Dideoxynucleotiden (ddNTPs) missen deze 3’-OH groep, waardoor zodra zo’n nucleotide wordt ingebouwd, de keten niet verder kan groeien — de synthese stopt.

Dit mechanisme wordt gebruikt om DNA-fragmenten te genereren die op verschillende lengtes stoppen, afhankelijk van waar de ddNTP is ingebouwd.

2. Klassieke Sanger sequencing (uit de jaren 1980)

Het DNA dat gesequenced moet worden, wordt verdeeld over vier aparte buisjes.
Elk buisje bevat:
- Een primer die bindt aan het template DNA.
- Alle vier de normale dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
- DNA-polymerase enzym.
- Één type radioactief gelabelde ddNTP (bijvoorbeeld ddATP in buisje 1, ddTTP in buisje 2, enzovoort) in zeer lage concentratie.
Tijdens de polymerisatiereactie worden normale nucleotiden ingebouwd, maar af en toe wordt een ddNTP ingebouwd, wat leidt tot keten-terminatie.
Omdat de incorporatie van ddNTPs willekeurig is, ontstaan fragmenten van verschillende lengtes die eindigen bij elke positie waar het ddNTP is ingebouwd.
Deze fragmenten worden gescheiden via polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), waarbij kortere fragmenten sneller migreren dan langere.
Door de radioactieve labels zichtbaar te maken met autoradiografie, kan men de lengte van de fragmenten aflezen en zo de DNA-volgorde bepalen.

3. Moderne Sanger sequencing met fluorescentie

In plaats van vier aparte buisjes, worden alle componenten gecombineerd in één buisje.
Elk type ddNTP is gelabeld met een unieke fluorescentie kleur (bijvoorbeeld geel, groen, blauw, rood).
Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, stopt de keten en het fragment draagt een fluorescerend label dat aangeeft welke base het was.
De fragmenten worden gescheiden via capillaire elektroforese, een geautomatiseerde techniek die sneller en nauwkeuriger is dan traditionele gels.
Een CCD-camera of een ander detectorapparaat leest de fluorescentiesignalen uit terwijl de fragmenten langs de detector passeren.
Dit maakt het mogelijk om de DNA-volgorde automatisch en in één keer te bepalen, zonder handmatige interpretatie van gels.

4. Chemische en structurele details

Een nucleotide bestaat uit een stikstofbase (A, T, G, C), een suikergroep (deoxyribose in DNA), en een fosfaatgroep.
Een nucleoside mist de fosfaatgroep.
Een deoxynucleotide (dNTP) mist de 2’-OH groep (in tegenstelling tot ribonucleotiden in RNA), maar heeft nog wel de 3’-OH groep.
Een dideoxynucleotide (ddNTP) mist zowel de 2’-OH als de 3’-OH groep, waardoor het keten-terminerend is.

5. Waarom is de 3’-OH groep zo belangrijk?

De 3’-OH groep is essentieel voor de vorming van de fosfodi-esterbinding tussen nucleotiden tijdens DNA-synthese. Zonder deze groep kan DNA-polymerase geen nieuwe nucleotide toevoegen, waardoor de keten stopt.

6. Samenvatting van het proces

| Stap | Beschrijving | |-------|--------------| | 1 | DNA-template wordt voorbereid met een primer. | | 2 | Reactiemix bevat normale dNTPs en een kleine hoeveelheid ddNTPs. | | 3 | DNA-polymerase begint met het synthetiseren van de complementaire streng. | | 4 | Incidentele incorporatie van ddNTP leidt tot keten-terminatie. | | 5 | Fragmenten van verschillende lengtes worden gescheiden via elektroforese. | | 6 | Fragmentlengtes worden geanalyseerd om de DNA-volgorde te bepalen. |

1. Inleiding en principe

Sanger sequencing is een methode om de exacte volgorde van nucleotiden in een DNA-molecuul te bepalen. Het is gebaseerd op het gebruik van dideoxynucleotiden (ddNTPs) die de DNA-synthese stoppen doordat ze ontbreken aan de 3’-OH groep die nodig is voor de verlenging van de DNA-keten.

Normale nucleotiden (dNTPs) bevatten een 3’-OH groep die essentieel is voor DNA-polymerase om een nieuwe nucleotide aan de groeiende keten te koppelen.
Dideoxynucleotiden (ddNTPs) missen deze 3’-OH groep, waardoor zodra een ddNTP wordt ingebouwd, de keten niet verder kan verlengen.

Dit mechanisme zorgt ervoor dat DNA-fragmenten van verschillende lengtes ontstaan, elk eindigend op een ddNTP, wat de basis vormt voor het bepalen van de DNA-volgorde.

2. Chemische structuur van nucleotiden

Nucleotide: bestaat uit een stikstofbase (A, T, G, C), een suikergroep (deoxyribose in DNA), en een fosfaatgroep.
Nucleoside: bestaat uit een stikstofbase en een suikergroep, maar mist de fosfaatgroep.
Deoxynucleotide (dNTP): nucleotide zonder 2’-OH groep (in tegenstelling tot RNA), maar met een 3’-OH groep.
Dideoxynucleotide (ddNTP): nucleotide zonder zowel 2’-OH als 3’-OH groepen, waardoor het keten-terminerend is.

3. Klassieke Sanger sequencing methode

Opzet

Het DNA dat gesequenced moet worden, wordt verdeeld over vier aparte buisjes.
Elk buisje bevat:
- Een primer die specifiek bindt aan het template DNA.
- Alle vier de normale dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
- DNA-polymerase enzym.
- Eén type radioactief gelabelde ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP of ddCTP) in zeer lage concentratie.

Werking

DNA-polymerase begint met het synthetiseren van de complementaire streng door dNTPs toe te voegen.
Incidenteel wordt een ddNTP ingebouwd in plaats van een dNTP, wat leidt tot keten-terminatie omdat er geen 3’-OH groep is om verder te verlengen.
Door de lage concentratie ddNTPs stopt de synthese op willekeurige plaatsen waar een ddNTP wordt ingebouwd.
Dit resulteert in een mengsel van DNA-fragmenten van verschillende lengtes, elk eindigend op een ddNTP.

Analyse

De fragmenten worden gescheiden op grootte via polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
Kortere fragmenten migreren sneller door de gel dan langere fragmenten.
De radioactieve labels maken de fragmenten zichtbaar via autoradiografie.
Door de positie van de fragmenten in de vier buisjes te vergelijken, kan de DNA-volgorde worden afgelezen.

4. Moderne Sanger sequencing methode met fluorescentie

Verbeteringen

In plaats van vier aparte buisjes, worden alle componenten gecombineerd in één buisje.
Elk type ddNTP is gelabeld met een unieke fluorescentie kleur (bijvoorbeeld geel, groen, blauw, rood).
Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, stopt de keten en het fragment draagt een fluorescerend label dat de identiteit van de laatste base aangeeft.

Analyse

De fragmenten worden gescheiden via capillaire elektroforese, een geautomatiseerde techniek die sneller en nauwkeuriger is dan traditionele gels.
Een CCD-camera of een ander detectorapparaat leest de fluorescentiesignalen uit terwijl de fragmenten langs de detector passeren.
Dit maakt het mogelijk om de DNA-volgorde automatisch en in één keer te bepalen, zonder handmatige interpretatie.

5. Belang van de 3’-OH groep

De 3’-OH groep is essentieel voor de vorming van de fosfodi-esterbinding tussen nucleotiden tijdens DNA-synthese.
DNA-polymerase katalyseert de binding tussen de 3’-OH van het laatste nucleotide en de 5’-fosfaatgroep van het nieuwe nucleotide.
Ontbreken van de 3’-OH groep (zoals bij ddNTPs) voorkomt deze binding, waardoor de keten stopt.

6. Samenvatting van het proces

| Stap | Beschrijving | |-------|--------------| | 1 | Voorbereiding van het DNA-template met een specifieke primer. | | 2 | Reactiemix bevat normale dNTPs en een kleine hoeveelheid ddNTPs (radioactief of fluorescent gelabeld). | | 3 | DNA-polymerase synthetiseert de complementaire streng. | | 4 | Incidentele incorporatie van ddNTP leidt tot keten-terminatie. | | 5 | Fragmenten van verschillende lengtes worden gescheiden via elektroforese (polyacrylamide gel of capillair). | | 6 | Detectie van labels (radioactief of fluorescent) maakt het mogelijk om de volgorde van het DNA af te lezen. |