帮助民众理解科研帮助学者做好科研朋友们大家好欢迎来到科研助理今天我们来探讨一个可能大家都很熟悉但是却又不那么熟悉的话题那就是PCR相信很多朋友可能都做过PCR实验甚至做过很多的PCR实验但是却不是特别了解PCR具体的技术原理实际上了解PCR基本技术原理可以帮助大家 更好的去完成PCR实验从而得到自己想要的目的片段我们都知道啊在大部分的生物都是由细胞构成而细胞中的遗传物质就是PCR的目标当然也有其他的遗传物质能够通过PCR技术进行扩增这个我们将在后面的视频给大家进行分享和讲解在开始PCR技术基本原理讲解之前我们首先了解一下 PCR的技术发明史为什么我们会想到PCR这样的一个技术就是因为DNA在体内有一个复制的过程这个过程就是PCR的体内模型在正常情况下DNA是双螺旋结构存在的所以说需要这个解旋酶和解链酶将DNA的双链分开DNA复制开始之后在解旋酶和解链酶的作用下将DNA分成双链随后 通过引物酶合成引物而这个引物呢会结合到即将要复制的DNA的片段的正确位置然后通过DNA聚合酶结合到引物上进行延伸从而产生一个和模板DNA一模一样的新的DNA链根据体类DNA的复制原理可赫尔安娜在1971年的时候提出了通过把DNA进行变性也就是把两条链分开并且以合成引物酶 合适的引物进行杂交再通过DNA聚合酶来延伸这个引物并且不断的去重复这个过程从而达到克隆基因的目的但是当时由于测序技术不够成熟并且合成引物也是比较困难的所以Kohorana的设想没有能成为现实直到1985年美国PE公司的Mulis正式发明了P3R技术可能大家对PE这个公司不是特别的熟但是P3R技术 对哈勃望远镜应该是熟悉的没错美国哈勃望远镜就是这个PE公司建设的Mulis的P32基本原理就是在试管当中去模拟细胞类的DNA复制最初它是采用大肠杆菌的DNA聚合酶来进行P32但是由于大肠杆菌的DNA聚合酶是不耐热的所以P32的过程每一次循环都需要添加酶所以说耗时费力而且在加酶的过程中需要经常操作 所以容易出错随后一种温泉菌中的DNA聚合没被发现并被应用到PCR当中这就使得了PCR通过改变温度就能够高效的运行PE公司呢也通过这样的理论推出了自己的第一台PCR1Mullis关于PCR的文章发表在了Science杂志上并被1989年Science杂志列为十项重大科学发明之首并且将1989年 比喻为PCR爆炸年Muniz也因此获得了诺贝尔化学奖Muniz PCR的构思是在目标片段的两端设计引物并通过DNA聚合酶对引物进行延伸从而获得特定的DNA片段Muniz PCR构思中涉及到四种PCR的关键组分包括高质量的DNA靶标片段合适的引物以及DNTP也就是我们常说的ATTC另外还要有 高质量的DNA聚合酶可能大家在自己的实验过程当中并没有听过这些主分但是我相信大家在做P32实验的过程当中一定用过一个东西叫MIX实际上这个MIX中就包括了除了DNA模板和引物之外的所有成分同时由于商业化的MIX具有较稳定的缓冲体系所以现在各个实验室已经很少在单独购买P32主分而是直接购买MIX关于MIX的购买 选择和使用我会专门做一些视频为大家进行介绍那么一个标准的P32反应体系各个组份的含量分别是多少呢四种DNTP的混合物为200微摩尔每升上下游引物各为10到100皮摩尔模板DNA为0.1到2微克包括2.5国际单位的DNA聚合酶和1.5毫摩尔每升的美离子另外还涉及到一些 缓冲体系需要的物质比如说像氨根离子我们会在不同的PCR目标过程当中 进行详细的讲解而对于一般的使用MIX进行的P32不会需要改变缓冲体系TAC DNA聚合酶是目前P32实验过程当中最常使用的DNA聚合酶这种聚合酶因为是从温泉精当中分离得到因此它具有耐高温的特性在72摄氏度的时候具有最佳的酶活性并且在高达94摄氏度的温度下也不会失火从而节省了我们每一个循环 都需要加煤的程序从而大大的缩减了PCR的工作量并且提高了PCR的效率同时由于在PCR反应过程当中需要使用到煤温度过高可能导致煤的失火所以一般不建议将PCR的变性温度调的过高一般在94摄氏度就可以了我们通过这张图可以简单总结PCR的基本原理首先是将体系温度加热到94摄氏度将DNA进行变性 形成两条单链的DNA从而解开DNA的双螺旋随后在55摄氏度左右让DNA的单链与引物进行复信复信实际上是引物和DNA结合的过程复信温度从55度到65摄氏度都有可能存在到底选择什么样的温度一般是要根据引物的特点来进行选择而如何设计一个符合PCR要求的引物我们后面会再做影片给大家解释随后 将体系维持在DNA聚合酶的最佳延伸温度一般也就是72摄氏度维持的时间根据自己的目标片段和酶的特性进行选择这个我们也将在后面再做影片给大家进行介绍重复上述步骤20到30个循环之后就会将基因扩增到100万倍以上接下来我们具体来看一下在我们P32反应体系里面每一步都发生了什么首先是在第一个循环的第一步 体系被加热到95摄氏度DNA双链解开这个过程称为变性变性过程体系中的DNA聚合酶上下游引物游离的核酸包括ATGC都处于游离的状态随后温度下降进入到复性过程引入和解链之后的DNA结合温度升高到72摄氏度进入延伸阶段由于DNA合成都是从五撇端到三撇端所以说DNA聚合酶 会结合在引物的三撇端为了让酶更好的工作引物三撇端最好富含AT原因我将在引物设计部分进行解释这里就不展开了实际上引物结合之后就已经进入了延伸但TAC DNA聚合酶在72摄氏度左右的酶的活性最高延伸速度最快因此我们的延伸会在72摄氏度进行在72摄氏度DNA聚合酶利用游离的ATGC合成新的DNA杂教链 这一条DNA杂交链由于P32新合成的链比原来的链要短所以说存在两条长度不一致的DNA双链随后再次把体系加热到95摄氏度变性双链再次解开进入第二个循环引物再次结合到合适的位置结合之后72摄氏度延伸这个时候我们可以看到目前还没有形成我们需要的目的片段进入第三个循环95摄氏度DNA片段完全解链之后 进入到退火阶段引物结合后再次延伸扩增通过前三个循环我们得到了两个目标DNA片段和六个两条链长不一致的DNA片段第四个循环我们将得到八个目标DNA片段和八个两条链长度不一致的DNA片段第五个循环我们将得到22个目标DNA片段和十个两条链长度不一致的DNA片段第六个循环将得到52个目标 DNA片段和12个两条链长度不一致的DNA片段为什么我在这里反复的说循环数和靶标DNA片段数的关系呢是因为某些P32过程当中这些数据是非常需要值得关注的关键问题这里先做一个铺垫后面的视频当中会有用我们在后面的视频中再进行解说另外在这里我们看到P32过程的产物并不是二的n次方这样的一个理想数据而是二的n次方减2n 2N指的是两条链长度不一致的DNA片段根据上面的公式可知我们再将一个DNA片段通过PCR的30个循环将获得10亿的DNA目标片段而这个时间通常会在4个小时以内而如果说目标片段短那么时间可能在一个小时到两个小时左右就可以完成这个PCR的实验基于PCR的基本原理PCR可以应用在多个方面包括基因诊断 基因治疗基因工程法医学检验人类学研究和动物学研究等等好的今天关于PCR基本原理就介绍到这里更多关于PCR的信息我将在接下来的影片进行介绍由于学识有限科学内容难免会有错误欢迎大家在评论区留言指出如果大家对PCR和其他的实验技术内容感兴趣欢迎大家订阅点赞评论和转发谢谢大家