Temario evaluación parcial:
* ADN: características, Chargaff.
* Replicación: etapas, estructuras necesarias para el desarrollo del proceso.
* PCR: procesos, materiales y equipamientos necesarios.
* Electroforesis: procesos, materiales y equipamientos necesarios, interpretación de resultados.
ADN:
El ADN (ácido desoxirribonucleico) constituye el material genético presente en el núcleo de las células. Es un polímero (sustancia o material que consiste de macromoléculas) complejo que alberga el código genético, el cual determina todas las características de un organismo vivo.
CARACTERÍSTICAS DEL MATERIAL GENÉTICO:
* contiene gran cantidad de información
* produce con precisión una copia de sí mismo antes de cada división celular.
* es químicamente estable.
* es capaz de cambiar o mutar.
CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DEL ADN:
* contiene dos cadenas antiparalelas que conforman una estructura helicoidal que se llama hélice.
* contiene 4 nucleótidos, los cuales son sus cuatro elementos fundamentales: A (adenina), T (timina), G (guanina) y C (citosina).
* Los genes son segmentos pequeños de ADN que contienen información genética específica.
El ADN presenta una estructura de doble hélice, la cual consiste en dos cadenas paralelas de ADN entrelazadas una alrededor de la otra.
Los nucleótidos constituyen las unidades fundamentales del
ADN; cada nucleótido está constituido por una base
nitrogenada, una unidad de azúcar pentosa y una de las
4 bases.
Cada nucleótido tiene una base; A (adenina), T (timina), G (guanina) y C (citosina).
* A y T son un par, G y C son otro par.
Los pares complementarios están unidos por enlaces de hidrógeno,
lo cual mantiene la estructura del ADN. Mientras que A y T tienen 2
enlaces de hidrógeno, G y C tienen 3.
Se visualizan de esta manera: A=T y G≡C
Los científicos James Watson y Francis Crick se basaron
en los trabajos de investigación de otros investigadores para
desvelar la estructura del ADN en 1953.
REGLA DE CHARGAFF:
La regla de Chargaff establece que en el ADN de doble hélice, la cantidad de A (adenina) es igual a la cantidad de T (timina), y la cantidad de G (guanina) es igual a la cantidad de C (citosina). Además, la suma de purinas (A+G) es igual a la suma de pirimidinas (T+C)
* A=T y G≡C
* A+G / T+C = 1
ARN
¿Qué es el ARN?
Es una molécula que contiene información genética y se encuentra en todas las células vivas. Es similar al ADN, pero se diferencia en que el ARN es monocatenario y contiene U (uracilo) en lugar de T (timina).
FUNCIONES
* El ARN transmite la información genética del ADN a la maquinaria celular que se encarga de sintetizar proteínas.
* Es el material genético de ciertos virus.
* Participa en la regulación de la expresión génica.
TIPOS DE ARN
snRNA o ARN nuclear pequeño está involucrado en el
procesamiento de moléculas de pre-mRNA dentro del
núcleo. Elimina intrones y une exones por medio del
splicing.
snoRNA o ARN nucleolar pequeño es un grupo diverso de
ADN que se encuentra en el núcleolo de cel. eucariotas.
modifica y procesa otras moléculas de ARN, más
particularmente tRNA y rRNA.
miRNA o microARN es una clase de moléculas de ARN NO codificantes que regulan la expresión génica de moléculas mRNA, inhibiendo la traducción o promoviendo la degradación del mRNA.
siRNA o ARN de interferencia corto es una molécula de ARN de doble cadena que silencia genes a través de la interferencia del ARN.
incRNA o ARN largo no codificante desempeña funciones en regulación de genes y procesos celulares. Son importantes en regulación de desarrollo, cáncer y otros procesos biológicos.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
¿Qué es PCR?
La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica laboratorial molecular que permite amplificar una secuencia específica de ADN en millones de copias en pocas horas. El objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la secuencia como para que esta pueda analizarse o estudiarse de alguna manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis o clonar para otros experimentos.
Es mayormente utilizado para:
* diagnósticos médicos: Detecta enfermedades infecciosas (causadas por virus o bacterias) como COVID-19, VIH/sida o hepatitis.
* Ciencia forense: analiza evidencia de ADN en investigaciones criminales.
* clonación de ADN: ya que crea múltiples copias de un segmento específico de ADN.
* Investigación/diagnóstico genético: estudia los genes y sus funciones.
PROCESOS
El proceso de la PCR se divide en 3 etapas clave, que se repiten en ciclos, los cuales son: desnaturalización, templado/alineamiento y extensión. Los materiales principales con los cofactores se colocan en un tubo y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis de ADN. Es una técnica para hacer réplicas de una región del ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de en un organismo)
Desnaturalización(20-30seg): La reacción se calienta a 96°C, para separar o desnaturalizar las cadenas de ADN. Se rompe la doble hélice de adn, se separan las dos hebras.
Templado/alineamiento(20-40seg): La reacción se enfría, entre 55° y 65°C para que los cebadores (primers) puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
Extensión(30-60seg): La temperatura de la reacción se vuelve a elevar a 72°C para que la Taq polimerasa extiende los cebadores (primers) y sintetice nuevas cadenas de ADN.
Estos pasos se repiten un aproximado de 25 a 35 veces para amplificar correctamente el ADN, y un proceso generalmente toma entre 2 o 4 horas. Si la reacción es eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco. No solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN.
También hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo.
MATERIALES PARA HACER LA PCR
* Se necesita del ADN molde, la cual contiene la muestra con la secuencia que se quiere amplificar.
* Al igual que en la replicación, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa. La que normalmente se utiliza en la PCR es Taq polimerasa, ya que contiene una bacteria termoestable (tolerante al calor al que se somete a la prueba).
* La Taq polimerasa sólo puede hacer ADN si hay un cebador o primer (una secuencia corta de nucleótidos que proporciona un punto de inicio para la síntesis de ADN). En una PCR, la región del ADN que será copiada o amplificada se determina por los cebadores que el investigador elija. Los cebadores de PCR (primers) son fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla que están diseñadas para franquear la región blanco (la región que debe ser copiada).
* nucleótidos dNTPs (A, T, C, G), bloques para construir nuevas hebras de ADN.
* Se necesita un Buffer de reacción, que mantiene el pH y las condiciones óptimas para la enzima.
* Por último, se necesitan Iones Mg²⁺, cofactor esencial para la actividad de la polimerasa.
EQUIPAMIENTOS NECESARIOS
* Se necesita de un Termociclador (o máquina de PCR), la cual automatiza los ciclos de temperatura requeridos para la PCR.
* Se introducen las muestras en el termociclador con Tubos PCR. Estas contienen la mezcla de reacción (ADN, cebadores, polimerasa, etc).
* Micropipetas y puntas estériles para medir y transferir líquidos con precisión.
* Y finalmente, si se analiza la muestra mediante electroforesis en gel con la muestra después, se utiliza una cámara de electroforesis en gel.