Dieses Video zum Thema Restriktionsenzyme ist eingebettet in eine Videoreihe zum Themenfeld Gentechnik, einem Themenfeld, das sich mit Methoden und Verfahren beschäftigt, mit denen man das Erbgut, die DNA von Organismen gezielt künstlich verändern kann. Häufig werden dabei Teile des Erbguts eines Organismus mithilfe eines Transportmoleküls, einem sogenannten Vektor, auf ein anderen Organismus übertragen. Dieser Vorgang drängt Fragen auf.
Wie werden DNA-Moleküle in kleinere Fragmente geschnitten? Wie fügt man diese Fragmente anschließend zusammen, um rekombinante, das heißt neu kombinierte DNA zu erzeugen? Und wie kann man diese in einen geeigneten Wirtsorganismus bzw. in eine Wirtszelle, in eine Zielzelle einschleusen? Um DNA-Moleküle in kleinere Fragmente zu schneiden, nutzt man Restriktionsenzyme.
die eigentlich so aussehen, hier entsprechend aber als Scheren dargestellt sind. Restriktionsenzyme sind die molekularen Grundwerkzeuge der Gentechnik, mithilfe derer sich rekombinante, also neu kombinierte DNA herstellen lässt. Es handelt sich dabei um DNA-Moleküle unterschiedlichen Ursprungs, wie auch hier dargestellt.
Restriktionsenzyme kommen natürlicherweise in Bakterien vor und sie sind in der Lage, spezifische DNA-Sequenzen zu erkennen und an ihnen zu schneiden. Genauer gesagt erkennen Restriktionsenzyme palindromische DNA-Sequenzen. Sequenzen mit einer spezifischen Abfolge von DNA-Basen, die von vorne nach hinten sowie von hinten nach vorne gleich zu lesen sind. Denkt beispielsweise an Palindrome wie Anna oder Otto, die auch rückwärts gelesen immer noch anhand Otto sind.
Das Restriktionsenzym ECO-R1 schneidet DNA innerhalb der abgebildeten spezifischen Erkennungssequenz. Wie ihr sicherlich wisst, liegt die DNA in Form eines Doppelstrangs bzw. einer Doppelhelix, also aus zwei Einzelsträngen, vor.
Um einzelne DNA-Fragmente isolieren zu können, ist eine solche Erkennungssequenz an nur einem der beiden Einzelstränge wenig hilfreich. Um die DNA-Doppelhelix aufzubrechen und später einzelne DNA-Fragmente zu erzeugen, muss die DNA an beiden Einzelsträngen geschnitten werden. Die Tatsache, dass es sich bei der spezifischen Erkennungssequenz um eine palindromische Sequenz handelt, die in 5-Strich-3-Strich-Richtung bei beiden Einzelsträngen als G-A-A-T-T-C zu lesen ist, gewährleistet, dass das Restriktionsenzym entsprechend beide Einzelstränge erkennen und schneiden kann.
Restriktionsenzyme schneiden die DNA immer zwischen zwei Basen innerhalb einer spezifischen Erkennungssequenz, die meist 4-8 Basenpaare lang ist. Einige Restriktionsenzyme schneiden die DNA genau in der Mitte des Palindroms und erzeugen glatte Enden. Andere wiederum, so auch das Restriktionsenzym 1 von Escherichia coli, schneidet die beiden DNA-Stränge an zwei verschiedenen Stellen.
Durch das versetzte Schneiden besitzt jedes Fragment ein überlappendes Ende, die sogenannten klebrigen Enden oder Sticky Ends. Entweder kleben die ursprünglichen Enden wieder zusammen, fügen sich also wieder zusammen, oder aber, und das ist entscheidend, die Sticky Ends verbinden sich über Wasserstoffbrückenbindung mit den komplementär überhängenden Basen anderer DNA-Fragmente, z.B. mit den Sticky Ends eines anderen Organismus, hier dargestellt durch die unterschiedliche Farbe für das DNA-Fragment des anderen Organismus, dessen Basenabfolge zwar nicht aufgeführt ist, die sich aber unterscheidet von der des anderen Organismus. Auf diese Weise lassen sich DNA-Fragmente mit unterschiedlichem Ursprung miteinander verbinden. Ein Fragment menschlicher Herkunft kann so mit einem Fragment, das von einem Bakterium stammt, verknüpft werden und rekombinante DNA erzeugen.
Neben den Restriktionsenzymen spielt die DNA-Ligase als weiteres Enzym eine bedeutende Rolle bei diesem Vorgang, denn sie katalysiert die Verknüpfung von DNA-Fragmenten. ebenso wie sie das schon bei der Verdopplung der DNA, der DNA-Replikation macht. Mit diesen Werkzeugen, Restriktionsenzymen und DNA-Ligase, sind Wissenschaftler in der Lage, DNA-Moleküle aus beliebiger Quelle zu zerschneiden und neu zusammenzufügen.
Warum sollte man dies tun? Ein Motiv, rekombinante DNA herzustellen, besteht darin, ein auf ihr liegendes Gen zu klonieren, also möglichst viele identische Kopien des Gens zu erzeugen. Es gibt Gene, die Proteine synthetisieren, die von so großem biologischem Nutzen sind, dass man diese Gene auf eine Zielzelle transferiert, mit dem Ziel, eine hohe Anzahl an Kopien des gewünschten Gens herzustellen. Man sagt auch, das Gen zu klonieren.
Die Vervielfältigung eines bestimmten Gens und dessen Genproduktes spielt in der Medizin zur Therapie von Krankheiten, bei denen Betroffene ein lebenswichtiges Protein als Genprodukt in Folge eines defekten Gens nicht in ausreichender Menge produzieren können, eine wichtige Rolle. Es gibt zum Beispiel Kinder, die das menschliche Wachstumshormon als Protein nur unzureichend synthetisieren, mit der Folge, dass sie eine geringe Körpergröße und oft auch andere Anomalien aufweisen. Während man die Betroffenen früher mit genau diesem Protein behandelte, das man aus dem Syntheseort der Hypophyse von Toten isolierte, wodurch der Bedarf natürlich nicht gedeckt werden konnte, gelang es mithilfe der Gentechnik, das Protein in Bakterien zu produzieren, und zwar in hoher Anzahl.
Mittlerweile hat man transgene Kühe erzeugt, die das menschliche Wachstumshormon in ihre Milch sezernieren, also abgeben. Für sich alleine hat die künstlich hergestellte rekombinante DNA noch keine biologische Bedeutung. Sie muss in eine lebende Zelle eingeschleust werden, welche die DNA repliziert, verdoppelt und die genetische Information transkribiert und so Genprodukte herstellt.
Für das Einschleusen der rekombinanten DNA in eine lebende Zelle, diese wird auch als Wirtszelle oder Zielzelle bezeichnet, wird in der Regel ein Transportmolekül, ein sogenannter Vektor benötigt. Bakterien enthalten kleine DNA-Ringe, die man als Plasmide bezeichnet, die sich so modifizieren lassen, dass sie rekombinante DNA in Zellen hineintransportieren. Häufig sind die zur Übertragung verwendeten Vektoren Plasmide, wobei auch Viren diese Aufgabe übernehmen können.
Auch ein Plasmid enthält mindestens eine Erkennungssequenz für Restriktionsenzyme, sodass das Plasmid einfach geschnitten und die Fremd-DNA mitsamt Gen gut eingefügt werden kann. Die Frage, wie genau die neu kombinierte DNA mithilfe von Vektoren in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeschleust wird, ist Gegenstand eines weiteren Videos. Abschließend möchte ich noch kurz die Fragen klären, welchen Nutzen Restriktionsenzyme in Bakterienzellen, die sie produzieren, haben und warum sie nicht die DNA dieser Bakterienzelle schneiden.
Bakterien müssen, genau wie jedes andere Lebewesen über Mechanismen verfügen, mit denen sie Feinde abwehren können. Ein Feind von Bakterien sind Viren, sogenannte Bakteriophagen, die die Viren angreifen, indem sie ihre DNA in die Bakterienzelle injizieren und sie zu einer Fabrik zur Herstellung von Viren verwandelt, wodurch die Bakterienzelle schließlich stirbt. Restriktionsenzyme können das eingeschleuste DNA-Molekül der Bakteriophagen in kleinere Fragmente zerschneiden und diese somit unschädlich machen. Neben diesem ausgeklügelten Abwehrmechanismus verfügen Bakterien über einen ebenso effektiven Mechanismus, der sie davor schützt, dass die Restriktionsenzyme nicht die Restriktionsschnittstellen in der eigenen DNA erkennen.
Diese sind methyliert. Das heißt, an ihnen sind sogenannte Methylgruppen, CH3-Gruppen, angeheftet, sodass die Restriktionsenzyme nicht binden können. Ganz im Gegensatz zu der nicht-methylierten DNA der Viren.
die sehr zuverlässig erkannt und geschnitten wird. Die Eigenschaft von Viren, Zellen auf natürliche Weise zu infizieren, indem sie ihre DNA in diese injizieren, macht sie übrigens interessant für die Nutzung als Vektoren und bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber Plasmide als Vektoren. Im Gegensatz zu Plasmide sind bei Viren keine künstlichen Maßnahmen erforderlich, um sie in eine Wirtszelle zu schleusen.