Istologia, lezione 2. In questa lezione analizzeremo la colorazione dei preparati istologici. La colorazione è l'ultima fase del processo di preparazione del campione. Il campione che ha subito fissazione, disidratazione e diafanizzazione, inclusione ed è stato sezionato va poi colorato.
colorazione è un processo fondamentale, non solo perché permette di osservare fisicamente un campione, ma anche per il fatto che ad ogni campione, ad ogni colore con cui vi viene colorato il campione, viene associata una caratteristica di una parte del tessuto. Quindi non solo permette l'osservazione, ma permette l'interpretazione del campione. Per questo è essenziale colorare. Quando si tratta di colorazione bisogna fare una distinzione tra tecniche di colorazione e coloranti.
Innanzitutto i coloranti sono dei diversi colori che possono essere utilizzati associandoli a tutti. Al mondo del disegno i colori sono i semplici rosso, blu, verde. Questi sono i coloranti. Per quanto riguarda invece le tecniche di colorazione, nel disegno noi possiamo utilizzare lo sfumato, il tratto pieno.
Queste sono le diverse tecniche di colorazione. La stessa cosa, la stessa distinzione si fa in campo istologico. Ci sono tre fondamentali tecniche di colorazione. Come?
Colorazione istologica, istochimica e immunohistochimica. La colorazione istologica permette di mettere in evidenza le caratteristiche morfologiche dei tessuti. Quindi permette di studiare la struttura di un tessuto. Questa tecnica di colorazione utilizza tre coloranti.
Tre coloranti che possono essere bicromici, tricromici, o elettivi. Poi c'è la colorazione istochimica che invece mette in evidenza le caratteristiche chimiche di un tessuto e si ottiene questa messa in evidenza andando a sviluppare una vera e propria reazione chimica e il precipitato di questa reazione verrà visto poi alla microscopia. Ancora più specifica è la colorazione immunohistochimica che mette in evidenza gli specifici antigeni presenti nelle cellule e nei tessuti. Analizziamo uno per uno queste tecniche di colorazione partendo dalla istologica. Una colorazione istologica fondamentale è la Zammallori.
Si tratta di una colorazione tricromica, cioè basata essenzialmente su tre colori. L'azocarminio, che permette di colorare delle strutture acide, come il nucleo e il maniaco. e in minor misura il citoplasma, poi c'è il blu di anilina che è un colorante acido e permette di colorare delle strutture come fibre di collagene e muco così come l'orangi. La Zan Mallory è formata essenzialmente da due parti, l'azocarminio e la miscela policroma di Mallory.
Tale miscela è formata da blu di anilina, orangi e acido ossalico. Nel complesso i campioni vengono colorati in questo modo. La colorazione probabilmente più impiegata in istologia è l'ematostilina eosina.
Si tratta di una colorazione bicromica che sfrutta le proprietà acide e basiche delle cellule. È formata da due coloranti. l'ematossilina che conferisce una colorazione blu violacea e l'eosina che conferisce una colorazione rossa-arancio.
L'ematossilina è un colorante basico, quindi acidofilo, che si lega alle strutture acide della cellula come il nucleo, che possiede l'acido desossidio-ribonucleico, o il citoplasma delle cellule più attive, che quindi possiedono ribosomi che sono formati da RNA. L'eosina colore invece le strutture più basiche. In generale, quindi, il nucleo viene colorato di blu violaceo e il citoplasma di un colore rosa-arancio. La colorazione di Gomory è una colorazione istologica elettiva, cioè che colora solo un determinato elemento. In questo caso si utilizza per colorare le fibre reticolari.
Il colorante utilizzato è un colorante a base di argento che ha una particolare affinità per le fibre reticolari. Ne deriva un tessuto in cui le fibre sono colorate di un nero intenso su uno sfondo grigio giallo. Le colorazioni Sudan 3 e Sudan Black vengono utilizzate per evidenziare le cellule adipose e soprattutto le goccioline lipidiche in esse contenute.
Sudan 3 viene utilizzato per colorarli di giallo, invece Sudan Black li colora di nero. Le colorazioni Sudan 3 e Sudan Black vengono applicate a dei campioni che sono stati sezionati con il criomicrotomo. Questo per il fatto che la fissazione viene fatta fisicamente per evitare che una fissazione chimica possa dissolvere i lipidi.
La colorazione di Nistel è una colorazione elettiva che viene utilizzata per colorare specificatamente la zona tigroide di Nistel. Il colorante è utilizzato il 2 di toluidina e viene utilizzato di solito su sezioni di paraffina che hanno 10 micrometri di spessura. La colorazione tipica del blu di Toledina è una colorazione sul blu azzurro. La colorazione di Golgica Gialle è una colorazione istologica che è specifica per il sistema nervoso centrale.
Si prendono dei piccoli pezzi freschi del sistema nervoso centrale, si immergono per 1-6 giorni. di 5°C in una soluzione osmiobicromica e successivamente in una soluzione di nitrato d'argento concentrato all'1% per 3 giorni. In seguito, quando è avvenuta la colorazione, si includono i pezzi di paraffine e si tagliano delle sezioni molto spesse.
almeno 40-50 micrometri per avere una visione di tutti gli elementi, una visione abbastanza completa, una colorazione abbastanza difficile da praticare che presenta ancora delle problematiche irrisolte. Di solito si ottiene un buon risultato quando si hanno le cellule nervose che spiccano in maniera di un colore nero intenso su uno sfondo color tabacco. Proprio per la riuscita difficile e incostante sono state realizzate delle problematiche.
fatte diverse proposte da autori diversi. Un'altra colorazione istologica è il Megrum Walchimsa. Si tratta di una colorazione specifica per il sangue che si fa in questo modo. Si strisce il sangue su un vetrino portaoggetti che poi viene fissato per 30 minuti all'aria. In seguito viene colorato prima con la miscela di May Grunwald e in seguito viene lavato col GIMS.
Il May Grunwald è formato da blu di metilene e osina, il primo è un colorante basico, il secondo lo conosciamo come blu di metilene. già un colorante acido. E poi il GIMSA che è fatto da eosina, blu di metilene, azzurro A e B e violetto di metilene che serve poi per lavare e colorare in seguito al Megrunwald.
Il risultato è che si ottengono dei globuli rossi colorati di un rosa-arancio e i nuclei dei globuli bianchi colorati in blu-violaceo. Passiamo alle tecniche di colorazione istochimica. Le tecniche di colorazione istochimica sono specifiche per alcuni elementi e si ottengono da una reazione chimica appunto. La reazione PAS serve per mettere in evidenza le mucine neutre.
Queste mucine sono inattivate per la reazione chimica. innanzitutto presenti in epitelise cernenti, ghiandola endocrine, ma anche nel sistema nervoso. È formata in questo modo, si utilizza innanzitutto un ossidante, cioè l'acido periodico.
Questo acido periodico innanzitutto... attacca in maniera specifica il gruppo funzionale amminico primario delle mucine oppure attacca il gruppo H, sempre delle mucine. In seguito all'attacco viene liberato il gruppo aldeico che viene messo in evidenza dal colorante che è il reattivo di Schiff.
Questo colorante colora le mucine con il gruppo aldeico che è stato mostrato di un colore rosso profondo. porpora. Di solito questa reazione si esegue in associazione all'alcian blu.
Mentre la reazione PAS colorava le mucine neutre, l'alcian blu colora le mucine acide e i glicosaminoglicani. Queste mucine e i glicosaminoglicani devono avere, devono contenere i gruppi carbosilici COOH. Questa reazione di solito si esegue insieme alla reazione PAS. Questo per avere un quadro completo delle mucine che sono presenti nel preparato.
Sia le mucine acide, che quindi si colorano con l'alchian, sia quelle neutre, che si colorano con il PAS. Un esempio di una reazione combinata PAS e alchian blu si utilizza per colorare alcune parti dello stomaco come l'andro, per colorare mucine con pH diverso. L'ultimo metodo di colorazione è quello immunistochimico. La colorazione immunistochimica sfrutta il legame antigene-anticorpo. Gli anticorpi che vengono utilizzati per la colorazione vengono trattati con l'aggiunta di un cromogeno.
Questo cromogeno Verrà avvicinato alle cellule del tessuto che bisogna osservare. In seguito si svilupperà la reazione anticorpo-antigene e l'antigene-antigene. anticorpo verrà eccitato con un laser. Questo laser porterà alla visualizzazione, all'evidenziazione del cromografo che renderà evidente la reazione che è avvenuta. In questo modo è possibile osservare le cellule in cui è avvenuta questa reazione.
L'ultimo argomento che tratteremo in questa lezione sono le sezioni istologiche. Una sezione è il tentativo di rendere una struttura tridimensionale come una sezione bidimensionale, perché quello che facciamo quando prepariamo un vetrino è prendere un tessuto che è tridimensionale e dividerlo in tante sezioni in modo che sembrino addirittura bidimensionali. Le sezioni sono essenzialmente di tre tipi.
Ci sono sezioni longitudinali, che sono delle sezioni dei tagli lungo l'asse maggiore di un oggetto che stiamo considerando. Una sezione trasversale è un taglio lungo l'asse minore dell'oggetto, è una sezione obliqua, è invece un taglio che viene effettuato a metà tra il trasversale e il longitudinale. Se prendiamo ad esempio... un tessuto di cellule di forma cilindrica prismatica, se tagliamo lungo l'asse maggiore di queste cellule otteniamo una sezione longitudinale, quindi delle cellule che rispecchiano in un certo senso la struttura bidimensionale di ogni cellula. Se noi un tessuto come questo con cellule cilindriche lo tagliamo in maniera obliqua otteniamo una struttura che non sembra rappresentare una struttura di cellule, ma è una struttura di cellule.
di quello che è il tessuto intridimensionale. Infatti sembrano delle sezioni di cellule che in realtà sono per lo più cubiche. Le sezioni di base sono quindi tre, trasversale, obliqua e longitudinale, però possiamo ottenere delle sezioni diverse anche a seconda, uno dell'oggetto che andiamo a tagliare, due di dove andiamo ad effettuare il taglio. Se prendiamo un semplice tubo e lo tagliamo trasversalmente nella zona centrale, otterremo come sezione bidimensionale semplicemente una circonferenza. Se tagliamo il tubo in maniera obliqua, otteniamo un'ellisse.
Se invece attuiamo una sezione longitudinale dobbiamo innanzitutto considerare due cose. Se lo tagliamo nella zona centrale lungo l'asse maggiore otterremo semplicemente due linee da un lato e dall'altro. Se invece tagliamo lungo la superficie, quindi non in zona centrale, otterremo una striscia continua e più spessa. Consideriamo invece un tubo che si rigira su se stesso, quasi a ferro di cavallo, e quindi la situazione si fa più complicata.
Un taglio trasversale, quindi lungo l'asse minore, però alla punta, nella zona in cui il tubo è. tubo curva otterremo un cerchio completo che non sembra rappresentare il tubo tridimensionale. Se tagliamo invece più verso i due lati del tubo otterremo un cerchio più vasto.
vasto, anche se di forma non propriamente circolare, più o meno nell'isse. Un taglio trasversale però lungo i due tubi ci faranno ottenere due cerchi che sono uniti, avvicinandoci sempre di più alla zona di curvatura, e meno uniti, sempre più separati, quando invece i due tubi non sono più uniti.