Trascrizione e traduzione dell'RNA

Biologia, lezione 13. In questa lezione finiremo di trattare l'argomento iniziato nella lezione precedente, cioè l'RNA, la trascrizione e la traduzione, con particolare riferimento ai processi di trascrizione e traduzione. Vediamo innanzitutto il processo chiamato trascrizione. La trascrizione è quindi il processo mediante cui il DNA viene aperto, Viene trascritto in RNA, dopodiché viene richiuso. Il trascritto sarà non congruente allo stampo originale, bensì complementare. La complementarietà rispetta la stessa legge della complementarietà dell'appaiamento delle due eliche del DNA, con l'unica differenza che al posto della timina l'RNA presenta la base azotata uracile. Questo processo viene portato avanti da un enzima chiamato RNA polimerasi che sintetizza l'RNA in direzione 5'-3'. Ovviamente il processo presenta delle caratteristiche diverse in prokaryoti ed eukaryoti. Cominciamo a parlare dei prokaryoti. Nei prokaryoti la trascrizione presenta una fase di inizio, una fase di allungamento e una fase di rilascio. La fase di inizio è la prima fase che si fa. Nella fase di inizio il DNA viene aperto. Ogni gene da trascrivere presenta esoni ed introni, ma soprattutto è molto importante notare che nella parte subito prima del gene da trascrivere è presente una piccola regione chiamata promoter. Noteremmo che è composto da diverse sequenze, una posta a meno 35 e l'altra a meno 10, dove il numero negativo indica il numero di basi prima dell'inizio del gene effettivo da trascrivere. Queste due sequenze servono per l'attacco della RNA polimerasi, in particolare per l'attacco del fattore sigma, un cofattore che serve appunto all'RNA polimerasi per legare il promotore. In particolare le subunità sigma2 e sigma4 legano le due parti speciali del promotore a meno 10 e meno 35. Tra le due è presente un segmento di 19 nucleotidi. La sequenza a-35 è composta da 6 nucleotidi, la sequenza a-10 è composta invece da altri 6 nucleotidi. Il fattore sigma è necessario per la trascrizione. Perché? Serve per individuare il sito di inizio della trascrizione, serve per consentire il legame iniziale con il DNA e oltretutto modula la velocità di lettura e scrittura. Vediamo un po' meglio come sono fatti questi promotori. Innanzitutto, la sequenza che si trova a meno 10 è formata da tre basi, A, G e T, per esempio. I promoter forti sono quei promoter che hanno una tripletta all'interno della zona che sta a meno 9 che è molto simile alla prima tripletta del gene da trascrivere. I promoter forti comportano un'alta velocità di scrittura della copia di RNA. Promoter deboli invece presentano una disomogeneità tra la zona del promoter e la prima parte del gene da trascrivere. Questi promoter sono quindi deboli nel senso che non inducono una trascrizione veloce, quindi il gene trascritto in modo più lento si esprimerà di meno. Diamo ora un'occhiata al vero e proprio processo. Innanzitutto l'RNA polimerasi scorre fino a trovare il promotore, dopodiché apre una bolla di 35 nucleotidi all'incirca chiamata bolla di trascrizione. lega il dna in maniera quasi stabile dopodichè avviene l'inizio vero e proprio inizia ad agganciare dei ribonucleotidi inizia quindi la fase di allungamento nella fase di allungamento Il DNA viene trascritto in direzione 5'-3'. Il processo è sempre lo stesso. Vengono aggiunti i nucleotidi usando come stampo il DNA. È interessante notare le subunità rudder e zipper che svolgono dei ruoli importanti. La rudder è molto utile nell'aggancio dei nuovi nucleotidi, mentre la zipper è utile per chiudere il DNA che è già stato letto. la velocità di lettura è di 50 nucleotidi al secondo. L'allungamento, quindi, prevede che il filamento di RNA si formi appaiato al filamento di DNA. Segue, infine, la fase del termine e del rilascio. Ci sono due modi per il termine e il rilascio, due modalità completamente diverse. La prima è quella degli RNA cosiddetti ro-indipendenti. In questo caso il filamento stampo di DNA presenta una grande quantità di basi GC e alla fine presenta molte adenine. Viene quindi formata una forcella che si ripiega a causa dell'alto contenuto in G e C e questa indebolisce il legame della polimerasi con il DNA. Il colpo di grazia viene dato dalle ultime basi. poiché il legame tra adeni e uracile è molto debole. Quindi l'RNA polimerasi si stacca da sola, senza bisogno di interventi esterni. L'RNA fa anche da terminatore. In altri casi, invece, il terminatore è costituito da un enzima vero e proprio, chiamato Rho. Per i geni che non hanno il terminatore Rho indipendente, deve intervenire appunto la proteina Rho, che è una ATPase ad anello, il cui compito è sfilare l'RNA dalla polimerasi e staccare l'enzima dal DNA. In questa immagine uno schema riassuntivo del concetto appena spiegato. Esistono ovviamente delle differenze tra la trascrizione eucariote e la trascrizione prokariote. Nei prokaryoti abbiamo visto che c'è un solo tipo di RNA polimerasi, mentre agli eukaryoti ne presentano ben tre. Nei prokaryoti c'è un solo cofattore, negli eukaryoti ce ne sono molti. Nei prokaryoti non abbiamo elementi di controllo come gli attivatori repressori, che invece sono presenti negli eukaryoti. Nei prokaryoti c'è un solo promotore, negli eukaryoti ci sono molti promotori, proprio perché esistono molte RNA polimerasi. Infine, i prokaryoti non hanno elementi regolatori a lunga distanza, cosa che accade per gli eukaryoti. Cominciamo a parlare della prima differenza. Gli eukaryoti hanno ben tre RNA polimerasi. L'RNA polimerasi 1 sintetizza gli RNA ribosomiali 28, 18 e 5.8S. L'RNA polimerasi 2 si occupa soprattutto dell'RNA messaggero. ma anche di alcuni piccoli RNA nucleari, nucleolari e i microRNA. L'RNA polimerasi 3 infine sintetizza i tRNA, l'RNA 5S e alcuni particolari tipi di piccoli RNA nucleari e citoplasmatici. Esistono poi altre forme più rare che sono l'RNA polimerasi 4 e 5 che sintetizzano i cRNA nelle piante, gli RNA polimerasi mitocondriale e dei cloroplasti. che si trovano appunto all'interno di questi organoli che come sappiamo sono piccole cellule all'interno della cellula la seconda differenza era riguardante i fattori di trascrizione negli eucarioti c'è un gran numero di fattori di trascrizione innanzitutto tutti i promotori o quasi tutti i promotori eucariotici presentano una sequenza chiamata tata box il tata box viene identificato e legato dal transcription factor conosciuto come tf2b. tf2d è fatto di due subunità, la tbp, che è il Tata Binding Protein, e il TAF. Questo insieme di fattori richiama il tf2a e il tf2b, che stabilizzano il legame con il DNA. A questo punto viene richiamata la RNA polimerasi. con il fattore tf2f si aggiunge a questo complesso poi tf2h, tf2j e tf2e questo è il complesso di preinizio, il macchinario della trascrizione la maggior parte dei fattori viene abbandonata e rimangono solo tf2d e tf2h tf2h attività elicasica quindi inizia a sciogliere i legami delle due eliche di dna e la rna polimerasi può iniziare la trascrizione Vediamo ora gli attivatori repressori. Negli eucarioti sono presenti un gran numero di elementi che si trovano a piccola distanza dal gene da trascrivere e sono chiamati enhancer e silencer. Questi pezzi di DNA hanno la funzione di aumentare o ridurre la trascrizione di un determinato gene e lo fanno agendo sui fattori di trascrizione attraverso delle molecole chiamate attivatori. Gli attivatori non legano direttamente i fattori di trascrizione ma lo fanno attraverso un complesso mediatore. Abbiamo inoltre detto che negli eucarioti ci sono più promotori. Il complesso promotore eucariote è diverso se si parla di polimerasi 1, polimerasi 2 o polimerasi 3. Per l'RNA polimerasi 1 abbiamo il seguente complesso. C'è il gene, che ricordiamo essere quello dell'RNA 28S, 18S e 5.8S. C'è il gruppo promotore core, che si trova tra meno 45 e più 20 basi, quindi può entrare anche all'interno del gene. Il core viene legato dal TF2D, che in questo caso presenta 3 subunità TAF. Poi, a meno 180 e meno 107 basi, c'è l'upstream control element. che lega un fattore chiamato UBF, che sta per Upstream Binding Factor, e il meccanismo della trascrizione si esplica attraverso il piegamento del DNA, che fa venire in contatto TF2D e UBF, e l'insieme di questi due fattori richiama l'RNA polimerasi che inizia la trascrizione dei geni ribosomiali. Per la RNA polimerasi 2 c'è il gene che codifica solitamente per mRNA, ma anche per alcuni piccoli RNA come gli SN, gli SNO e i microRNA. Poi ci sono alcuni elementi che fanno da core, che si trovano tra meno 35 e più 30 basi. Poi ci sono alcuni elementi regolatori prossimali, che sono attivatori o repressori, che si trovano tra meno 50 e meno 200 basi. Infine ci sono enhancers e silencers, più altre sequenze, che si possono trovare oltre le meno mille basi. Questi sono gli elementi regolatori distali. Ognuno lega un attivatore o un repressore. L'RNA polimerasi 3, poi, ha quattro tipi di promotori diversi. Il primo, per l'RNA 5S, è un promotore interno doppio, il box A e il box C. Il secondo, per i tRNA, è sempre un promotore interno ma presenta il box A e il box B. Per gli snRNA abbiamo un promotore completamente esterno che comprende il TATA box, l'oct e il pse. Infine, per l'RNA 7SL, la cui utilità vedremo in seguito, abbiamo un promotore misto che presenta i box A e B interni più il TATA e il tf. Adesso parliamo dell'ultima fase del dogma centrale della biologia, cioè la traduzione. La traduzione è il processo mediante cui dall'RNA, messaggero, transfer e ribosomiale, si ottengono delle proteine. Fanno parte di questo processo anche alcuni enzimi, come l'aminoacilti RNA sintetasi, i fattori di traduzione, attenzione, e gli sciaperon e le foldasi. La prima fase è conosciuta come attivazione degli amminoacidi. L'attivazione degli amminoacidi consiste nel legame a un semplice amminoacido di una certa quantità di energia fornita dal GTP. L'aminocil-tRNA sintetasi lega sia il GTP che l'amminoacido. Dopo idrolizza due fosfati del GTP e lega il GMP all'aminoacido. è un legame che ovviamente libera una molecola d'acqua. Si forma quindi un intermedio chiamato amminoacil GMP. A questo punto interviene l'RNA transfer che si lega in un terzo sito attivo e l'enzima a questo punto può collegare l'amminoacido al tRNA slegando il GMP che cede quindi la sua ultima parte di energia immagazzinandola nel legame tra l'amminoacido e il tRNA. A questo punto avviene il processo di proofreading, cioè avviene il controllo che l'amminoacido legato al tRNA sia quello giusto. C'è un errore ogni 40.000 accoppiamenti. Subito dopo abbiamo la fase di inizio. L'inizio avviene quando il ribosoma è ancora separato. Il ribosoma presenta una subunità maggiore, che prima dell'inizio è inibita dall'IF6, e una subunità minore, che è legata sempre ai fattori IF1 e IF3. Intanto il tRNA con l'aminoacido legato è legato ai due fattori IF2. Ogni IF2 è portatore di un pacchetto di energia sotto forma di GTP. L'amminoacilti RNA lega la subunità minore. Questo si chiama complesso di preinizio. Il complesso di preinizio, a questo punto, individua l'RNA. Come può individuarlo? Perché l'RNA lega altri fattori di inizio chiamati F4A, F4A e F4G. alla poli A dell'RNA messaggero, la coda di lunghe adenine. IF4A a questo punto lega il CAP, la 7-metilguanosina, per controllare che l'aggancio sia ottimale. In seguito il ribosoma lega questi fattori formando il complesso di inizio vero e proprio e scorre fino a trovare la tripletta AUG che segnala l'inizio della parte da trascrivere a questo punto abbiamo il rilascio di un IF2 sotto forma di idrolisi del GTP che permette la distruzione del fattore IF6 cosa che libera la subunità maggiore del ribosoma che andrà a legarsi alla subunità minore. La subunità maggiore presenta tre tasche una è chiamata E, la seconda è chiamata P, la terza è chiamata A. Il primo tRNA si lega nel sito P. Il sito A è detto amminoacidico in quanto ogni nuovo amminoacido che entrerà nella proteina si legherà al sito A. Il sito P è detto peptidico perché ogni catena peptidica, alloggerà sempre nel sito P. Il sito 3 è detto anche E o Exit, vuol dire uscita, in quanto ogni tRNA che si troverà nel sito Exit verrà slegato dall'RNA messaggero e mandato via. Vediamo ora la fase di allungamento. Nella fase di allungamento Abbiamo l'intervento di altri amminoacidi tRNA che portano insieme a loro un EF1, Elongation Factor 1. L'EF1 è portatore di una quantità di energia sotto forma di GTP. L'amminoacido si lega al sito A, poi viene spesa l'energia del GTP e l'amminoacido presente sul primo tRNA si sposta sul RNA appena entrato. Si inizia quindi a formare un peptide. A questo punto interviene l'elongation factor 2 che si lega in coda al ribosoma e sfruttando l'energia dell'idrolisi spinge il ribosoma spostando il peptide nel sito peptidico. e il trna vuoto nel sito di uscita. Interviene a questo punto Un altro amminoacil-tRNA con il fattore di allungamento 1, portante anche egli una certa quantità di energia, che viene spesa per far avvenire il legame peptidico tra i primi due amminoacidi e l'amminoacido appena portato. Il termine rilascio è l'ultima fase della trascrizione in senso stretto. Arrivati nella fase terminale, EF2 spinge il ribosoma sfruttando come energia l'idrolisi del GTP e lo porta sull'ultima tripletta che è una tripletta non senso. A questo punto rimane solamente il tRNA del sito peptidilico perché quello del sito exit viene rimosso. e nel sito amminoacidico si lega un tRNA vuoto, perché parliamo di una tripletta non senso. A questo punto il peptide si sposta sul tRNA vuoto, ma questo spostamento catalizza una rottura idrolitica del legame per cui si libera una molecola d'acqua e il peptide si slega dal tRNA, diventando indipendente. L'ultimo procedimento è il taglio della metionina, il primo amminoacido. La metionina infatti fa solo da segnale, serve solo per iniziare la traduzione, in quanto la tripletta d'inizio è sempre la tripletta AUG che codifica per la metionina. Terminata quindi la traduzione, la metionina deve essere rimossa. Infine c'è la fase delle modifiche post-traduzionali. Queste modifiche sono operate da alcuni organuli particolari. Abbiamo l'aggiunta di glucidi, chiamata glicosilazione, l'aggiunta di lipidi, che induce un ripiegamento molto particolare della proteina. Abbiamo anche la formazione di ponti di solfuro, tra due estremità molto lontane della stessa proteina. Abbiamo poi la fosforilazione, molto importante per attivare o deattivare alcune proteine. E abbiamo anche semplici reazioni di taglio proteolitico. Le modifiche post-traduzionali servono perché la proteina, da semplice collana di perle, cioè da semplice insieme di amminoacidi, diventi una proteina perfettamente ripiegata, con struttura 3D precisa, in quanto la funzione di tutte le proteine è legata alla loro struttura tridimensionale, detta anche struttura terziaria. Il tempo di ripiegamento, cioè di acquisizione della struttura terziaria, ha generato uno dei più conosciuti paradossi della biologia, il paradosso di Levinthal. Se infatti Si considera che il numero di conformazioni possibili per una proteina di 100 amminoacidi e si suppone che ogni amminoacido possa esplorare al massimo 3 conformazioni, si ottiene che questo numero è pari a 10 alla 87. Se una proteina dovesse esplorare casualmente tutte queste combinazioni, per ripiegarsi impiegherebbe 20 miliardi di anni. Il paradosso di Leventhal vuole esporre come il ripiegamento delle proteine non sia casuale, ma avvenga secondo delle leggi ben precise. Il biologo Dawkins ipotizzò infatti che non è che una proteina deve provare 10 all'87 combinazioni. Semplicemente ogni volta che un amminoacido va a posto, cioè occupa la conformazione corretta, quello si blocca e non può più tornare in una posizione scorretta. Secondo Dawkins, questo avviene perché la struttura primaria delle proteine, cioè la sequenza di aminoacidi, è fatta già in modo da avere intrinsecamente la capacità di ripiegarsi in maniera tridimensionale. Molte delle modifiche post-traduzionali che riguardano il ripiegamento vengono operate dalle foldasi e dagli chaperon, dette anche head shock proteins. Gli chaperone sono delle proteine molto particolari, vengono prodotte quando l'organismo viene sottoposto a shock di calore, perché il calore denatura le proteine. Allora, la produzione di chaperone serve a rinaturare le proteine che si sono denaturate durante la febbre. Ci sono anche altre condizioni, come gli stati patologici o alcuni fattori di crescita, che inducono la formazione di chaperone. esistono gli chaperon veri e propri detti anche chaperon propriamente detti che inducono un vero ripiegamento della proteina ed esistono quelle chaperonine che aiutano semplicemente la proteina a ripiegarsi difetti degli chaperon portano a patologie da accumulo come la mucolipidosi. Infatti, il deficit di funzione delle proteine lisosomali dovuto a uno scorretto ripiegamento porta all'accumulo di muco, mucine e lipidi, con comparsa precoce di lineamenti grossolani nel viso, anomalie osse, oltre a un ritardo psicomotorio. Tutto questo per un anormale ripiegamento della proteina. Ovviamente la traduzione non avviene ad opera di un solo ribosoma, ma un singolo RNA messaggero si attacca a molto più di un ribosoma. Si forma quindi una conformazione chiamata polisoma, in cui diversi ribosomi sono stati diversi del processo di traduzione. Un argomento strettamente legato alla traduzione è l'effetto dei farmaci antibiotici. Molti antibiotici infatti agiscono bloccando la traduzione nei batteri. Le tetracicline per esempio bloccano il legame tra il sito A e il tRNA. Il cloram fenicolo invece blocca la peptidiltrasferasi dell'RNA 23S dei batteri, equivalente del 28S dei ribosomi eucarioti. La streptomicina causa invece una errata lettura del codice ad opera della subunità minore infine l'eritromicina blocca il fattore di allungamento numero 2 va detto che questo stesso metodo di induzione della morte cellulare è utilizzato anche da alcuni batteri la tossina difterica per esempio ha lo stesso effetto dell'eritromicina ma sulla cellula eucarioti Vediamo ora l'indirizzamento delle proteine. Le proteine possono essere indirizzate sia secondo la via escretoria, sia secondo la via citoplasmatica. La via escretoria prevede il RER, il Golgi, e dopo, a seconda dei segnali di indirizzamento secondario, si va all'esterno, o verso il lisosomio, o verso la membrana. Tutto questo è mediato dalla SRP, Signal Recognition Protein. Una proteina riconoscente il segnale che si trova sul reticolo endoplasmatico rugoso e riconosce il segnale di indirizzamento primario, cioè una determinata sequenza all'interno dell'RNA messaggero. L'altra via è quella citoplasmatica, cioè la trascrizione viene ad opera dei ribosomi liberi nel citoplasma. Il segnale di indirizzamento primario è la prima porzione della proteina appena sintetizzata dal RER. Oltre la proteina matura è presente quindi questo segnale di indirizzamento formato da una regione positiva, una regione idrofoba e una regione polare. La molecola SRP è fatta per riconoscere questo segnale e legare il ribosoma che sta traducendo al RER. Dopodiché l'intera proteina viene sintetizzata all'interno del lume del RER grazie a una proteina canale. Se questo segnale non è presente, le proteine vengono tradotte da RNA ribosomiali presenti nel citoplasma. Il destino delle proteine, come abbiamo già visto nelle lezioni precedenti, può seguire varie vie, o una via secretoria o una via costitutiva, o essere immessi all'interno dei perossisomi, dei lisosomi. o entrare nei mitocondri. La distruzione delle proteine è un processo molto interessante e molto finemente regolato. Le proteine di base durano da alcuni minuti fino a parecchi giorni. Vengono distrutte per vari motivi. Evitare l'accumulo delle proteine anomale, che causa una serie di patologie chiamate malattie da accumulo. Evitare l'accumulo di quelle normali divenute inutili. e infine favorire il riciclo degli amminoacidi. La distruzione può seguire o la via lisosomale o la via ubiquitino dipendente. La via lisosomale è una semplice distruzione grazie all'autofagocitosi. La via ubiquitino dipendente prevede invece che alla proteina vengano legate quattro molecole di ubiquitina. Queste vengono riconosciute da un complesso enzimatico chiamato proteasoma che ha la funzione di tagliare effettuare quindi molti tagli proteolitici per ridurre la proteina in piccoli frammenti peptidici tutto ciò che abbiamo visto finora è possibile grazie al codice genetico e alle sue caratteristiche il codice genetico è un codice che viene letto a triplette Ogni parola dotata di senso deve avere tre basi Non ha sovrapposizione Cioè non esiste un modo di leggerlo anomalo Non può essere spostata alla cornice di lettura Ogni tripletta va letta all'interno della tripletta stessa Non è che una lettera viene letta con la tripletta successiva Il codice non ha punteggiatura è tutto attaccato. Il codice è degenerato poiché esistono più triplette che possono codificare per uno stesso amminoacido. Questa caratteristica è chiamata anche ridondanza. Il codice è quasi universale, sono solo due o tre le forme di vita che presentano un codice genetico lievemente diverso, ma in tutte le forme di vita o quasi Una stessa tripletta significa uno stesso amminoacido. Ovviamente il codice avrà dei segnali di inizio e fine, dove il segnale di inizio è la tripletta AUG che codifica per la metionina. I segnali finali sono corrisposti dalla tripletta UAG, UAA oppure UGA. Queste triplette dette non senso indicano il termine della trascrizione e della traduzione. Il codice può presentare dei nucleotidi insoliti, come l'inosina, e presenta anche un fenomeno chiamato vacillamento dell'anticodon, per cui uno stesso tRNA messaggero può legare diverse forme di RNA messaggero. L'inosina è una base molto particolare. è conosciuta anche come base anomala poiché ha la capacità di legare sia l'adenina, sia l'uracile, sia la citosina. Oltre all'inosina esistono anche altre basi come la teoridina, la metilguanosina, la ribotimidina, eccetera. Sono basi molto particolari e vengono incorporate a causa di piccole variazioni avvenute durante l'evoluzione. Sono rare, tuttavia. L'ultima caratteristica del codice genetico è la ridondanza, che però è dovuta al vacillamento dell'anticodon. Come mai diverse triplette possono codificare per uno stesso amminoacido? Questo avviene perché, mentre la tripletta sull'RNA messaggero è lineare, sull'RNA transfer la tripletta si trova su un'ansa, quindi le tre basi divergono. Perciò... le prime due basi si legheranno bene, l'ultima non si legherà quasi. Quindi che all'ultimo posto ci sia una guanina, una denina o qualsiasi altra base, il risultato non cambierà, per cui triplette diverse potranno codificare per uno stesso aminoacido, perché riusciranno a legare l'RNA transfer. che presenta omologia tra le prime due basi ma l'ultima base diversa. Il legame avviene lo stesso perché a causa della forma curvilinea dell'anza dell'anticodon Il legame dell'ultima base non deve avvenire in maniera stretta, ma basta un limite minimo di interazioni.

Questo processo viene portato avanti da un enzima chiamato RNA polimerasi che sintetizza l'RNA in direzione 5'-3'. Ovviamente il processo presenta delle caratteristiche diverse in prokaryoti ed eukaryoti. Cominciamo a parlare dei prokaryoti. Nei prokaryoti la trascrizione presenta una fase di inizio, una fase di allungamento e una fase di rilascio. La fase di inizio è la prima fase che si fa.

Nella fase di inizio il DNA viene aperto. Ogni gene da trascrivere presenta esoni ed introni, ma soprattutto è molto importante notare che nella parte subito prima del gene da trascrivere è presente una piccola regione chiamata promoter. Noteremmo che è composto da diverse sequenze, una posta a meno 35 e l'altra a meno 10, dove il numero negativo indica il numero di basi prima dell'inizio del gene effettivo da trascrivere.

Queste due sequenze servono per l'attacco della RNA polimerasi, in particolare per l'attacco del fattore sigma, un cofattore che serve appunto all'RNA polimerasi per legare il promotore. In particolare le subunità sigma2 e sigma4 legano le due parti speciali del promotore a meno 10 e meno 35. Tra le due è presente un segmento di 19 nucleotidi. La sequenza a-35 è composta da 6 nucleotidi, la sequenza a-10 è composta invece da altri 6 nucleotidi.

Il fattore sigma è necessario per la trascrizione. Perché? Serve per individuare il sito di inizio della trascrizione, serve per consentire il legame iniziale con il DNA e oltretutto modula la velocità di lettura e scrittura.

Vediamo un po' meglio come sono fatti questi promotori. Innanzitutto, la sequenza che si trova a meno 10 è formata da tre basi, A, G e T, per esempio. I promoter forti sono quei promoter che hanno una tripletta all'interno della zona che sta a meno 9 che è molto simile alla prima tripletta del gene da trascrivere.

I promoter forti comportano un'alta velocità di scrittura della copia di RNA. Promoter deboli invece presentano una disomogeneità tra la zona del promoter e la prima parte del gene da trascrivere. Questi promoter sono quindi deboli nel senso che non inducono una trascrizione veloce, quindi il gene trascritto in modo più lento si esprimerà di meno.

Diamo ora un'occhiata al vero e proprio processo. Innanzitutto l'RNA polimerasi scorre fino a trovare il promotore, dopodiché apre una bolla di 35 nucleotidi all'incirca chiamata bolla di trascrizione. lega il dna in maniera quasi stabile dopodichè avviene l'inizio vero e proprio inizia ad agganciare dei ribonucleotidi inizia quindi la fase di allungamento nella fase di allungamento Il DNA viene trascritto in direzione 5'-3'.

Il processo è sempre lo stesso. Vengono aggiunti i nucleotidi usando come stampo il DNA. È interessante notare le subunità rudder e zipper che svolgono dei ruoli importanti.

La rudder è molto utile nell'aggancio dei nuovi nucleotidi, mentre la zipper è utile per chiudere il DNA che è già stato letto. la velocità di lettura è di 50 nucleotidi al secondo. L'allungamento, quindi, prevede che il filamento di RNA si formi appaiato al filamento di DNA.

Segue, infine, la fase del termine e del rilascio. Ci sono due modi per il termine e il rilascio, due modalità completamente diverse. La prima è quella degli RNA cosiddetti ro-indipendenti. In questo caso il filamento stampo di DNA presenta una grande quantità di basi GC e alla fine presenta molte adenine.

Viene quindi formata una forcella che si ripiega a causa dell'alto contenuto in G e C e questa indebolisce il legame della polimerasi con il DNA. Il colpo di grazia viene dato dalle ultime basi. poiché il legame tra adeni e uracile è molto debole. Quindi l'RNA polimerasi si stacca da sola, senza bisogno di interventi esterni. L'RNA fa anche da terminatore.

In altri casi, invece, il terminatore è costituito da un enzima vero e proprio, chiamato Rho. Per i geni che non hanno il terminatore Rho indipendente, deve intervenire appunto la proteina Rho, che è una ATPase ad anello, il cui compito è sfilare l'RNA dalla polimerasi e staccare l'enzima dal DNA. In questa immagine uno schema riassuntivo del concetto appena spiegato.

Esistono ovviamente delle differenze tra la trascrizione eucariote e la trascrizione prokariote. Nei prokaryoti abbiamo visto che c'è un solo tipo di RNA polimerasi, mentre agli eukaryoti ne presentano ben tre. Nei prokaryoti c'è un solo cofattore, negli eukaryoti ce ne sono molti.

Nei prokaryoti non abbiamo elementi di controllo come gli attivatori repressori, che invece sono presenti negli eukaryoti. Nei prokaryoti c'è un solo promotore, negli eukaryoti ci sono molti promotori, proprio perché esistono molte RNA polimerasi. Infine, i prokaryoti non hanno elementi regolatori a lunga distanza, cosa che accade per gli eukaryoti.

Cominciamo a parlare della prima differenza. Gli eukaryoti hanno ben tre RNA polimerasi. L'RNA polimerasi 1 sintetizza gli RNA ribosomiali 28, 18 e 5.8S.

L'RNA polimerasi 2 si occupa soprattutto dell'RNA messaggero. ma anche di alcuni piccoli RNA nucleari, nucleolari e i microRNA. L'RNA polimerasi 3 infine sintetizza i tRNA, l'RNA 5S e alcuni particolari tipi di piccoli RNA nucleari e citoplasmatici. Esistono poi altre forme più rare che sono l'RNA polimerasi 4 e 5 che sintetizzano i cRNA nelle piante, gli RNA polimerasi mitocondriale e dei cloroplasti.

che si trovano appunto all'interno di questi organoli che come sappiamo sono piccole cellule all'interno della cellula la seconda differenza era riguardante i fattori di trascrizione negli eucarioti c'è un gran numero di fattori di trascrizione innanzitutto tutti i promotori o quasi tutti i promotori eucariotici presentano una sequenza chiamata tata box il tata box viene identificato e legato dal transcription factor conosciuto come tf2b. tf2d è fatto di due subunità, la tbp, che è il Tata Binding Protein, e il TAF. Questo insieme di fattori richiama il tf2a e il tf2b, che stabilizzano il legame con il DNA. A questo punto viene richiamata la RNA polimerasi. con il fattore tf2f si aggiunge a questo complesso poi tf2h, tf2j e tf2e questo è il complesso di preinizio, il macchinario della trascrizione la maggior parte dei fattori viene abbandonata e rimangono solo tf2d e tf2h tf2h attività elicasica quindi inizia a sciogliere i legami delle due eliche di dna e la rna polimerasi può iniziare la trascrizione Vediamo ora gli attivatori repressori.

Negli eucarioti sono presenti un gran numero di elementi che si trovano a piccola distanza dal gene da trascrivere e sono chiamati enhancer e silencer. Questi pezzi di DNA hanno la funzione di aumentare o ridurre la trascrizione di un determinato gene e lo fanno agendo sui fattori di trascrizione attraverso delle molecole chiamate attivatori. Gli attivatori non legano direttamente i fattori di trascrizione ma lo fanno attraverso un complesso mediatore.

Abbiamo inoltre detto che negli eucarioti ci sono più promotori. Il complesso promotore eucariote è diverso se si parla di polimerasi 1, polimerasi 2 o polimerasi 3. Per l'RNA polimerasi 1 abbiamo il seguente complesso. C'è il gene, che ricordiamo essere quello dell'RNA 28S, 18S e 5.8S. C'è il gruppo promotore core, che si trova tra meno 45 e più 20 basi, quindi può entrare anche all'interno del gene.

Il core viene legato dal TF2D, che in questo caso presenta 3 subunità TAF. Poi, a meno 180 e meno 107 basi, c'è l'upstream control element. che lega un fattore chiamato UBF, che sta per Upstream Binding Factor, e il meccanismo della trascrizione si esplica attraverso il piegamento del DNA, che fa venire in contatto TF2D e UBF, e l'insieme di questi due fattori richiama l'RNA polimerasi che inizia la trascrizione dei geni ribosomiali. Per la RNA polimerasi 2 c'è il gene che codifica solitamente per mRNA, ma anche per alcuni piccoli RNA come gli SN, gli SNO e i microRNA. Poi ci sono alcuni elementi che fanno da core, che si trovano tra meno 35 e più 30 basi.

Poi ci sono alcuni elementi regolatori prossimali, che sono attivatori o repressori, che si trovano tra meno 50 e meno 200 basi. Infine ci sono enhancers e silencers, più altre sequenze, che si possono trovare oltre le meno mille basi. Questi sono gli elementi regolatori distali.

Ognuno lega un attivatore o un repressore. L'RNA polimerasi 3, poi, ha quattro tipi di promotori diversi. Il primo, per l'RNA 5S, è un promotore interno doppio, il box A e il box C.

Il secondo, per i tRNA, è sempre un promotore interno ma presenta il box A e il box B. Per gli snRNA abbiamo un promotore completamente esterno che comprende il TATA box, l'oct e il pse. Infine, per l'RNA 7SL, la cui utilità vedremo in seguito, abbiamo un promotore misto che presenta i box A e B interni più il TATA e il tf.

Adesso parliamo dell'ultima fase del dogma centrale della biologia, cioè la traduzione. La traduzione è il processo mediante cui dall'RNA, messaggero, transfer e ribosomiale, si ottengono delle proteine. Fanno parte di questo processo anche alcuni enzimi, come l'aminoacilti RNA sintetasi, i fattori di traduzione, attenzione, e gli sciaperon e le foldasi. La prima fase è conosciuta come attivazione degli amminoacidi. L'attivazione degli amminoacidi consiste nel legame a un semplice amminoacido di una certa quantità di energia fornita dal GTP.

L'aminocil-tRNA sintetasi lega sia il GTP che l'amminoacido. Dopo idrolizza due fosfati del GTP e lega il GMP all'aminoacido. è un legame che ovviamente libera una molecola d'acqua.

Si forma quindi un intermedio chiamato amminoacil GMP. A questo punto interviene l'RNA transfer che si lega in un terzo sito attivo e l'enzima a questo punto può collegare l'amminoacido al tRNA slegando il GMP che cede quindi la sua ultima parte di energia immagazzinandola nel legame tra l'amminoacido e il tRNA. A questo punto avviene il processo di proofreading, cioè avviene il controllo che l'amminoacido legato al tRNA sia quello giusto. C'è un errore ogni 40.000 accoppiamenti. Subito dopo abbiamo la fase di inizio.

L'inizio avviene quando il ribosoma è ancora separato. Il ribosoma presenta una subunità maggiore, che prima dell'inizio è inibita dall'IF6, e una subunità minore, che è legata sempre ai fattori IF1 e IF3. Intanto il tRNA con l'aminoacido legato è legato ai due fattori IF2.

Ogni IF2 è portatore di un pacchetto di energia sotto forma di GTP. L'amminoacilti RNA lega la subunità minore. Questo si chiama complesso di preinizio.

Il complesso di preinizio, a questo punto, individua l'RNA. Come può individuarlo? Perché l'RNA lega altri fattori di inizio chiamati F4A, F4A e F4G. alla poli A dell'RNA messaggero, la coda di lunghe adenine.

IF4A a questo punto lega il CAP, la 7-metilguanosina, per controllare che l'aggancio sia ottimale. In seguito il ribosoma lega questi fattori formando il complesso di inizio vero e proprio e scorre fino a trovare la tripletta AUG che segnala l'inizio della parte da trascrivere a questo punto abbiamo il rilascio di un IF2 sotto forma di idrolisi del GTP che permette la distruzione del fattore IF6 cosa che libera la subunità maggiore del ribosoma che andrà a legarsi alla subunità minore. La subunità maggiore presenta tre tasche una è chiamata E, la seconda è chiamata P, la terza è chiamata A. Il primo tRNA si lega nel sito P.

Il sito A è detto amminoacidico in quanto ogni nuovo amminoacido che entrerà nella proteina si legherà al sito A. Il sito P è detto peptidico perché ogni catena peptidica, alloggerà sempre nel sito P. Il sito 3 è detto anche E o Exit, vuol dire uscita, in quanto ogni tRNA che si troverà nel sito Exit verrà slegato dall'RNA messaggero e mandato via. Vediamo ora la fase di allungamento. Nella fase di allungamento Abbiamo l'intervento di altri amminoacidi tRNA che portano insieme a loro un EF1, Elongation Factor 1. L'EF1 è portatore di una quantità di energia sotto forma di GTP.

L'amminoacido si lega al sito A, poi viene spesa l'energia del GTP e l'amminoacido presente sul primo tRNA si sposta sul RNA appena entrato. Si inizia quindi a formare un peptide. A questo punto interviene l'elongation factor 2 che si lega in coda al ribosoma e sfruttando l'energia dell'idrolisi spinge il ribosoma spostando il peptide nel sito peptidico. e il trna vuoto nel sito di uscita. Interviene a questo punto Un altro amminoacil-tRNA con il fattore di allungamento 1, portante anche egli una certa quantità di energia, che viene spesa per far avvenire il legame peptidico tra i primi due amminoacidi e l'amminoacido appena portato.

Il termine rilascio è l'ultima fase della trascrizione in senso stretto. Arrivati nella fase terminale, EF2 spinge il ribosoma sfruttando come energia l'idrolisi del GTP e lo porta sull'ultima tripletta che è una tripletta non senso. A questo punto rimane solamente il tRNA del sito peptidilico perché quello del sito exit viene rimosso. e nel sito amminoacidico si lega un tRNA vuoto, perché parliamo di una tripletta non senso. A questo punto il peptide si sposta sul tRNA vuoto, ma questo spostamento catalizza una rottura idrolitica del legame per cui si libera una molecola d'acqua e il peptide si slega dal tRNA, diventando indipendente.

L'ultimo procedimento è il taglio della metionina, il primo amminoacido. La metionina infatti fa solo da segnale, serve solo per iniziare la traduzione, in quanto la tripletta d'inizio è sempre la tripletta AUG che codifica per la metionina. Terminata quindi la traduzione, la metionina deve essere rimossa. Infine c'è la fase delle modifiche post-traduzionali. Queste modifiche sono operate da alcuni organuli particolari.

Abbiamo l'aggiunta di glucidi, chiamata glicosilazione, l'aggiunta di lipidi, che induce un ripiegamento molto particolare della proteina. Abbiamo anche la formazione di ponti di solfuro, tra due estremità molto lontane della stessa proteina. Abbiamo poi la fosforilazione, molto importante per attivare o deattivare alcune proteine. E abbiamo anche semplici reazioni di taglio proteolitico.

Le modifiche post-traduzionali servono perché la proteina, da semplice collana di perle, cioè da semplice insieme di amminoacidi, diventi una proteina perfettamente ripiegata, con struttura 3D precisa, in quanto la funzione di tutte le proteine è legata alla loro struttura tridimensionale, detta anche struttura terziaria. Il tempo di ripiegamento, cioè di acquisizione della struttura terziaria, ha generato uno dei più conosciuti paradossi della biologia, il paradosso di Levinthal. Se infatti Si considera che il numero di conformazioni possibili per una proteina di 100 amminoacidi e si suppone che ogni amminoacido possa esplorare al massimo 3 conformazioni, si ottiene che questo numero è pari a 10 alla 87. Se una proteina dovesse esplorare casualmente tutte queste combinazioni, per ripiegarsi impiegherebbe 20 miliardi di anni. Il paradosso di Leventhal vuole esporre come il ripiegamento delle proteine non sia casuale, ma avvenga secondo delle leggi ben precise.

Il biologo Dawkins ipotizzò infatti che non è che una proteina deve provare 10 all'87 combinazioni. Semplicemente ogni volta che un amminoacido va a posto, cioè occupa la conformazione corretta, quello si blocca e non può più tornare in una posizione scorretta. Secondo Dawkins, questo avviene perché la struttura primaria delle proteine, cioè la sequenza di aminoacidi, è fatta già in modo da avere intrinsecamente la capacità di ripiegarsi in maniera tridimensionale.

Molte delle modifiche post-traduzionali che riguardano il ripiegamento vengono operate dalle foldasi e dagli chaperon, dette anche head shock proteins. Gli chaperone sono delle proteine molto particolari, vengono prodotte quando l'organismo viene sottoposto a shock di calore, perché il calore denatura le proteine. Allora, la produzione di chaperone serve a rinaturare le proteine che si sono denaturate durante la febbre.

Ci sono anche altre condizioni, come gli stati patologici o alcuni fattori di crescita, che inducono la formazione di chaperone. esistono gli chaperon veri e propri detti anche chaperon propriamente detti che inducono un vero ripiegamento della proteina ed esistono quelle chaperonine che aiutano semplicemente la proteina a ripiegarsi difetti degli chaperon portano a patologie da accumulo come la mucolipidosi. Infatti, il deficit di funzione delle proteine lisosomali dovuto a uno scorretto ripiegamento porta all'accumulo di muco, mucine e lipidi, con comparsa precoce di lineamenti grossolani nel viso, anomalie osse, oltre a un ritardo psicomotorio. Tutto questo per un anormale ripiegamento della proteina. Ovviamente la traduzione non avviene ad opera di un solo ribosoma, ma un singolo RNA messaggero si attacca a molto più di un ribosoma.

Si forma quindi una conformazione chiamata polisoma, in cui diversi ribosomi sono stati diversi del processo di traduzione. Un argomento strettamente legato alla traduzione è l'effetto dei farmaci antibiotici. Molti antibiotici infatti agiscono bloccando la traduzione nei batteri.

Le tetracicline per esempio bloccano il legame tra il sito A e il tRNA. Il cloram fenicolo invece blocca la peptidiltrasferasi dell'RNA 23S dei batteri, equivalente del 28S dei ribosomi eucarioti. La streptomicina causa invece una errata lettura del codice ad opera della subunità minore infine l'eritromicina blocca il fattore di allungamento numero 2 va detto che questo stesso metodo di induzione della morte cellulare è utilizzato anche da alcuni batteri la tossina difterica per esempio ha lo stesso effetto dell'eritromicina ma sulla cellula eucarioti Vediamo ora l'indirizzamento delle proteine. Le proteine possono essere indirizzate sia secondo la via escretoria, sia secondo la via citoplasmatica.

La via escretoria prevede il RER, il Golgi, e dopo, a seconda dei segnali di indirizzamento secondario, si va all'esterno, o verso il lisosomio, o verso la membrana. Tutto questo è mediato dalla SRP, Signal Recognition Protein. Una proteina riconoscente il segnale che si trova sul reticolo endoplasmatico rugoso e riconosce il segnale di indirizzamento primario, cioè una determinata sequenza all'interno dell'RNA messaggero.

L'altra via è quella citoplasmatica, cioè la trascrizione viene ad opera dei ribosomi liberi nel citoplasma. Il segnale di indirizzamento primario è la prima porzione della proteina appena sintetizzata dal RER. Oltre la proteina matura è presente quindi questo segnale di indirizzamento formato da una regione positiva, una regione idrofoba e una regione polare.

La molecola SRP è fatta per riconoscere questo segnale e legare il ribosoma che sta traducendo al RER. Dopodiché l'intera proteina viene sintetizzata all'interno del lume del RER grazie a una proteina canale. Se questo segnale non è presente, le proteine vengono tradotte da RNA ribosomiali presenti nel citoplasma.

Il destino delle proteine, come abbiamo già visto nelle lezioni precedenti, può seguire varie vie, o una via secretoria o una via costitutiva, o essere immessi all'interno dei perossisomi, dei lisosomi. o entrare nei mitocondri. La distruzione delle proteine è un processo molto interessante e molto finemente regolato.

Le proteine di base durano da alcuni minuti fino a parecchi giorni. Vengono distrutte per vari motivi. Evitare l'accumulo delle proteine anomale, che causa una serie di patologie chiamate malattie da accumulo. Evitare l'accumulo di quelle normali divenute inutili.

e infine favorire il riciclo degli amminoacidi. La distruzione può seguire o la via lisosomale o la via ubiquitino dipendente. La via lisosomale è una semplice distruzione grazie all'autofagocitosi. La via ubiquitino dipendente prevede invece che alla proteina vengano legate quattro molecole di ubiquitina. Queste vengono riconosciute da un complesso enzimatico chiamato proteasoma che ha la funzione di tagliare effettuare quindi molti tagli proteolitici per ridurre la proteina in piccoli frammenti peptidici tutto ciò che abbiamo visto finora è possibile grazie al codice genetico e alle sue caratteristiche il codice genetico è un codice che viene letto a triplette Ogni parola dotata di senso deve avere tre basi Non ha sovrapposizione Cioè non esiste un modo di leggerlo anomalo Non può essere spostata alla cornice di lettura Ogni tripletta va letta all'interno della tripletta stessa Non è che una lettera viene letta con la tripletta successiva Il codice non ha punteggiatura è tutto attaccato.

Il codice è degenerato poiché esistono più triplette che possono codificare per uno stesso amminoacido. Questa caratteristica è chiamata anche ridondanza. Il codice è quasi universale, sono solo due o tre le forme di vita che presentano un codice genetico lievemente diverso, ma in tutte le forme di vita o quasi Una stessa tripletta significa uno stesso amminoacido. Ovviamente il codice avrà dei segnali di inizio e fine, dove il segnale di inizio è la tripletta AUG che codifica per la metionina.

I segnali finali sono corrisposti dalla tripletta UAG, UAA oppure UGA. Queste triplette dette non senso indicano il termine della trascrizione e della traduzione. Il codice può presentare dei nucleotidi insoliti, come l'inosina, e presenta anche un fenomeno chiamato vacillamento dell'anticodon, per cui uno stesso tRNA messaggero può legare diverse forme di RNA messaggero. L'inosina è una base molto particolare. è conosciuta anche come base anomala poiché ha la capacità di legare sia l'adenina, sia l'uracile, sia la citosina.

Oltre all'inosina esistono anche altre basi come la teoridina, la metilguanosina, la ribotimidina, eccetera. Sono basi molto particolari e vengono incorporate a causa di piccole variazioni avvenute durante l'evoluzione. Sono rare, tuttavia. L'ultima caratteristica del codice genetico è la ridondanza, che però è dovuta al vacillamento dell'anticodon. Come mai diverse triplette possono codificare per uno stesso amminoacido?

Questo avviene perché, mentre la tripletta sull'RNA messaggero è lineare, sull'RNA transfer la tripletta si trova su un'ansa, quindi le tre basi divergono. Perciò... le prime due basi si legheranno bene, l'ultima non si legherà quasi. Quindi che all'ultimo posto ci sia una guanina, una denina o qualsiasi altra base, il risultato non cambierà, per cui triplette diverse potranno codificare per uno stesso aminoacido, perché riusciranno a legare l'RNA transfer.

che presenta omologia tra le prime due basi ma l'ultima base diversa. Il legame avviene lo stesso perché a causa della forma curvilinea dell'anza dell'anticodon Il legame dell'ultima base non deve avvenire in maniera stretta, ma basta un limite minimo di interazioni.

Transcript for:Trascrizione e traduzione dell'RNA

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Trascrizione e traduzione dell'RNA