Disfunção dos Telômeros e Suas Doenças

Meu nome é Rodrigo Calado, sou professor da divisão de hematologia e hemoterapia do Departamento de Clínica Médica aqui da faculdade e um dos investigadores do Centro de Terapia Celular aqui do Hemocentro. E hoje eu vou falar sobre a linha de pesquisa dentro do meu laboratório a respeito de um novo conjunto de doenças que anteriormente eram reconhecidas separadamente. Mas que hoje a gente pode, do ponto de vista de mecanismo molecular de doença, agrupar essas doenças que atingem órgãos diferentes ou tecidos diferentes e que são, na sua maioria, doenças graves, mas nós podemos agrupar essas doenças de acordo com um mecanismo molecular comum que, no caso, é uma disfunção dos telômeros, que são... justamente os telômeros, as pontas, como a gente pode ver aqui em amarelo, dos nossos cromossomos. Acho que muitos de vocês já ouviram eu falar, mas só para lembrar de que os nossos cromossomos, eles são lineares e isso aconteceu em algum momento durante a evolução, em que desde que a gente deixou de ser bactéria e deixou de ter o DNA circular, como acontece nos plasmídeos. O nosso DNA passou a ser linear, isso trouxe várias vantagens para a célula do ponto de vista de recombinação de material genético, que facilita muito provavelmente a recombinação de material genético durante a meiose, então é uma vantagem por essa razão. Por outro lado, ela impõe um problema à célula durante a divisão mitótica. Então existe esse problema. Desbalanço entre as vantagens meióticas da célula e as desvantagens mitóticas da célula. Isso porque dentro da célula, uma molécula de DNA ou cromossomo tenta esconder as extremidades de uma molécula de DNA, as extremidades 5'e 3'da molécula de DNA. Porque elas normalmente são reconhecidas pela maquinaria de reparo do DNA, como um DNA lesado ou um DNA infeccioso, como por exemplo o DNA de um vírus. E a maquinaria de reparo do DNA, na maioria das vezes por recombinação de ponta não homóloga, tenta recuperar ou reparar. essas pontas, extremidades 5'e 3'do DNA. Então, quando a nossa molécula deixa de ser linear, que não tem ponta nenhuma, ela passa a ser, deixa de ser circular e passa a ser linear, isso faz com que a molécula tenha que esconder essas extremidades 3'e 5'da molécula do nosso cromossomo para que isso não ative a maquinaria de reparo do DNA. E para isso, os nossos cromossomos têm uma estrutura bastante complexa, que é ribonucleoproteica, ou seja, existe a parte de nucleotídeos, que é justamente essas sequências repetidas de TTAGG, que fazem uma estrutura como um nó, um laço na ponta dos nossos cromossomos, que é esse tilupe que a gente está vendo aqui no slide, que, como são sequências repetidas... A ponta dos nossos cromossomos, ela é assimétrica, a extremidade 3 linha da fita líder, ela é mais longa do que a extremidade 5 linha da fita complementar. De tal sorte que existe uma pequena extremidade, uma pequena ponta que é de fita simples. Isso permite que essa ponta de fita simples, ela se dobra de volta sobre a sequência repetida e ela... se anele com a mesma sequência de TTA, GGG e faz com que a gente tenha essa volta, um nó na ponta dos nossos cromossomos. Além disso, essa sequência TTA, GGG é reconhecida especificamente por uma série de proteínas, diretamente pelo menos por duas, que são TURF1 e TURF2, que a gente está vendo ali. que reconhecem a dupla fita de TTA-GGG e pelo menos uma outra proteína que reconhece a fita simples de TTA-GGG que é a POT1. que está representada aqui. E essas proteínas, então, têm a função de cobrir ou dar abrigo a essa estrutura de nucleotídeos e esconder essa estrutura da maquinaria de reparo do DNA. Se você, por algum mecanismo exógeno, faz um knockdown ou deleta, silencia alguns desses genes aqui, em especial o TIF2 ou o TIRF1, TIRF2, TPP1, por exemplo, você expõe na célula essas extremidades e imediatamente você vai ver uma recombinação, uma junção ponta a ponta dos cromossomos da célula. Isso é fácil de fazer no laboratório, demonstrando a importância de cada uma dessas proteínas e a importância dessa estrutura que existe na ponta dos nossos cromossomos. Esse é então um dos problemas que existem quando... Foi a evolução escolheu o cromossomo linear, ou que essa estrutura linear dos cromossomos surgiu como um benefício. Mas o outro malefício é que a DNA polimerase, ela não é capaz de replicar completamente a ponta dos nossos cromossomos. É por isso, essa é uma das razões que você tem essa assimetria entre a extremidade 5'e 3'. Isso por conta de uma inabilidade característica da DNA polimerase, sobre o qual não vou entrar aqui muito em detalhes, mas que foi reconhecida por um biólogo teórico na Rússia, mais especificamente em Moscou, na década de 70, de que a DNA polimerase não tem essa capacidade de duplicar a ponta. totalmente dos telômeros, o que faz com que inevitavelmente em toda duplicação mitótica a fita recém-sintetizada vai ser mais curta do que a fita molde. Então isso leva a o que ele chamou de marginotomia, que é o corte das margens ou problema da replicação das pontas. Isso faz com que inevitavelmente os nossos... Telômeros, e aqui é uma medida dos telômeros, isso em leucócitos do sangue periférico, desde o cordão umbilical até a nona ou décima década de vida em humanos, em indivíduos saudáveis, faz com que os nossos telômeros se encurtem à medida que a gente envelhece. Esse é um grupo de mais ou menos 200 indivíduos saudáveis. medidos, esses aqui no caso, por uma técnica que é o QPCR, mas existem várias formas de a gente determinar isso. Para que a gente pudesse analisar melhor essa forma, a dinâmica do comprimento telomérico, aqui na FMRP, a Fernanda Gutierrez, que na época era aluna de mestrado, e hoje aluna de doutorado, está fazendo parte. Um sanduíche do doutorado no NIH no momento, ela desenvolveu uma técnica que é o Flowfish, que é uma combinação de citometria de fluxo junto com a hibridização in situ, de uma população de mais ou menos 200 doadores saudáveis, a maioria aqui são doadores do hemocentro, doadores de sangue aqui do hemocentro, mas existem também crianças saudáveis e alguns indivíduos mais idosos saudáveis, o Dimas está mais ou menos... por aqui, olha. E você vê que, em comparação à curva anterior, existe mais ou menos uma constante dessa curva, e eu vou mostrar outras curvas feitas em outros locais que seguem o mesmo padrão, que ela tem uma equação de terceiro grau, tem um polinomial de terceiro grau, que você vê que tem uma... Redução mais rápida durante as primeiras duas décadas de vida, isso fica mais devagar durante a vida adulta e depois aqui dos 70 anos mais ou menos, isso volta a acelerar o encurtamento telomérico. Mas a gente fazer isso mais ou menos como uma constante, a equação da Fernanda é de que a gente perde cerca de 47 pares de base por ano. Nessa outra curva que eu tinha feito no laboratório antes, que dava 52 pares de base por ano, que é o número que eu gosto mais, porque dá um par de base por semana. Mas é mais ou menos a mesma coisa. Então você vê que existe uma dinâmica e um padrão do encurtamento telomérico entre os diversos indivíduos. Isso é fundamental. Então, para a gente entender o que acontece em diversas doenças. Algumas das nossas células, elas precisam, portanto, você pode imaginar que se isso acontecesse indefinidamente, não só a humanidade como a vida com cromossomos lineares desapareceriam da superfície da Terra, porque os cromossomos iam escurtando até que eles desapareceriam. Para evitar que exista esse encurtamento telomérico, ou... indefinido, algumas células em algum momento da evolução também, provavelmente incorporaram algum vírus no material genético que continha uma transcriptase reversa, que a gente chama de telomerase ou TERT, que está representada aqui por essa bola laranja. A telomerase é uma transcriptase reversa, cujos sítios da transcriptase em si são muito conservados e muito semelhantes, por exemplo, à transcriptase reversa do HIV. Por isso que... A ideia é que isso provavelmente tenha sido a incorporação de algum vírus de RNA, que tem transcriptase reversa, que possa ter dado essa capacidade às nossas células. E a telomerase, ela usa uma molécula de RNA, que aqui é representado por esse TURC, que serve como molde para estender a extremidade 3'dos nossos cromossomos. Só que esse complexo da telomerase, ele é expresso a... apenas em algumas células muito específicas, que têm uma capacidade muito alta de proliferativa, sejam as células troncoembrionárias ou as células troncoadultas, como as células troncoematopoéticas, que nos interessam mais, mas também algumas outras células que têm alta proliferação, como os linfócitos ativados, sejam linfócitos T, linfócitos B, e cerca de 90% dos... Diferentes tipos de cânceres também super expressam a telomerase como um mecanismo de dar capacidade proliferativa às suas células. Mas não é só a telomerase, o TERT e o TURC que são importantes, vocês veem que existem várias outras proteínas que estabilizam esse complexo e dentre elas eu vou destacar aqui a diserina, porque ela fica no cromossomo X e tem uma importância clínica muito grande. Mas existem outras estruturas como aquelas proteínas da xelterina, sobre as quais eu havia falado anteriormente. E existem outras proteínas como a helicase RTL1, por exemplo, que ela é fundamental para desfazer aqui o nó do tilup e desfazer algumas estruturas que existem na região dos telômeros. Ela resolve várias dessas estruturas e eu vou falar a respeito disso daqui a pouco. O encurtamento excessivo dos telômeros, eles levam, como vocês podem imaginar, a uma parada proliferativa, uma senescência proliferativa das células. A célula para de proliferar quando os telômeros são muito curtos. E isso foi inicialmente detectado num tipo de falência da medula óssea, um tipo de anemia plástica congênita chamada de ceratose congênita, que foi descrita acerca de... Uns 100 anos aproximadamente, por conta dessa tríade dessas alterações nas unhas, que parece que tem uma micose na unha, tem essas alterações na pele aqui, que também parece uma micose de piscina. E existem essas leucoplasias, que são essas manchas brancas na língua, na bochecha interna da pessoa. Então essa tríade chama disceratose porque tem uma alteração da queratina. Disceratose ou disqueratose. E inicialmente o grupo do Inderjet-Dokal, na época ele estava no Hospital Hummersmith em Londres, ele conseguiu numa família, isso atinge algum dos padrões de herança da disceratose congênita, é ligado ao X, e em uma dessas famílias, que acometia apenas meninos, ele conseguiu numa época pré-histórica, na década de... final da década de 90, que não existia muito sequenciamento, você fazia análise de linkage e ficava fazendo um monte de salvemblote para achar onde está isso, onde está aquilo, um trabalho interminável, tedioso, incompreensível, e que eles conseguiram localizar uma região no cromossomo X ligada à doença nessa família. encontraram um gene, isso quando toda essa bioinformática que a gente tem hoje ainda era rudimentar, provavelmente você precisava colocar CD ou flop disc no computador para poder reconhecer as sequências, e chamaram o gene que existia nessa região. região de DKC1 de serina. E na época não se sabia exatamente o que que essa proteína exatamente fazia, se imaginava que ela pudesse estar relacionada à função de ribossomos, ribossomos estavam bastante na moda na época, mas um ano depois, uma pesquisadora de Stanford, a Kathy Collins, que trabalhava com a biologia de telômeros, Ela demonstrou que, na verdade, essa discerina, que é aquela proteína que eu mostrei anteriormente para vocês, não tinha, pelo menos, nenhuma importância nos ribossomos, mas, efetivamente, ela fazia parte do complexo da telomerase em vários estudos, mostrando, então, que o papel essencial da discerina é dar estabilidade ao complexo da telomerase. Como esse gene fica no cromossomo X, Os meninos que têm uma mutação nesse gene, nessa proteína, portanto, têm uma deficiência praticamente absoluta da discerina e têm um fenótipo bastante intenso, mas o que causa a morte, infelizmente, dessas crianças não são essas alterações da pele, mas a medula óssea desses pacientes para de funcionar. Aqui nós temos uma imagem. de uma biópsia de medula óssea de um indivíduo saudável, em que a gente tem as trabéculas ósseas e por dentro, então, o conteúdo hematopoético da medula óssea, e essa é a medula óssea de um paciente com anemia plástica, seja congênita, seja adquirida, em que você pode ver que o tecido hematopoético é substituído por gordura. E existe uma diferença fundamental aqui, nessa aplasia, em que ela é substituída por gordura na anemia plástica, de, por exemplo, na aplasia que acontece em um paciente que recebe quimioterapia ou um paciente que recebe radioterapia. Ele também vai ter uma certa aplasia, mas ela não vai ser necessariamente substituída por gordura. Mas, mais do que isso, no indivíduo que recebe quimioterapia e radioterapia, as células-tronco e progenitoras hematopoéticas, elas permanecem intactas. Ou, na grande maioria delas, elas não são atingidas. pela radioterapia, em especial aquelas que estão em G0. Então, a partir de um determinado momento, elas conseguem recuperar, que você não tem mais a ação da rádio, da quimioterapia, elas conseguem recuperar a celularidade na medula e a hematopoese. Ao contrário do que acontece aqui, tem que você ter uma profunda deficiência das células tronco e progenitoras hematopoéticas, que levam, então, à aplasia dessa medula óssea. E a gente já sabia mais ou menos da mesma época em que pacientes de anemia plástica tinham uma progressão, um encurtamento telomérico, só que isso ainda era duvidoso se isso era uma causa ou um efeito da anemia plástica. E esse trabalho da Kathy Collins juntou as peças do quebra-cabeça e mostrou que, na verdade, esse encurtamento dos telômeros... provavelmente, pelo menos na disceratose congênita, era uma causa da doença. Um defeito genético que leva a um defeito da telomerase, encurtamento dos telômeros e isso faz com que você diminua a proliferação da célula tronco-hermatopoética. Diante disso, a gente foi procurar, então, um grupo maior de pacientes com anemia plástica. aparentemente adquirida, não aqueles casos de ceratose congênita, que não tem aquelas alterações da unha, nenhuma alteração dermatológica, se eles tinham mutação no gene da telomerase, especificamente, que fica em um cromossomo autossômico. E o que nós identificamos foi que esses pacientes, nós encontramos cerca de um pouco mais de uma meia dúzia de pacientes héteros e gotos para a mutação. da telomerase, então eles têm cerca de 50% da telomerase funcional. E o que é interessante é que eles tinham uma certa história de familiar de mielodisplasia ou de leucemia mieloide aguda. E esses pacientes aqui é uma outra curva do Canadá, também por flowfish, cada ponto amarelo é um indivíduo saudável lá, canadense. Mais ou menos o que é importante é que vocês vão ver que a forma, esse shape da curva permanece. independente da população que você olha. Mas esses pacientes com anemia plástica e mutação da telomerase tinham telômeros muito mais curtos do que a população em geral, mostrando que você tem essa mutação, leva a uma deficiência da enzima, da transcriptase reversa e um encurtamento excessivo dos telômeros. Então, do ponto de vista meu, que sou hematologista, a anemia plástica a gente conseguiu linkar ou associar Do ponto de vista causa e efeito, muito bem a deficiência da telomerase, mas como havia dito, existem outras doenças que posteriormente, eu não vou entrar muito em detalhes aqui, que também estão associadas a esse defeito genético. E na verdade são vários defeitos genéticos, e hoje a gente tem uma visão muito mais complexa e interessante desse defeito. genético, levando a uma alteração do mecanismo fundamental da célula, que é a manutenção do comprimento telomérico que acontece em cada uma das nossas células, mas mutações de uma série de genes diferentes envolvidos na manutenção dos telômeros podem causar essa doença. A disceratose congênita é o caso mais extremo da doença dos telômeros. Esses pacientes, invariavelmente, têm telômeros muito curtos. Essa doença, primeiro, que a gente conseguiu associar é anemia plástica, mas com base no perfil, tanto dos próprios pacientes, quanto de familiares, a gente conseguiu observar que isso também estava associado à fibrose pulmonar idiopática ou à fibrose pulmonar familiar, eu não vou falar muito a respeito disso hoje, mas também à doença hepática, em especial cirrose hepática e esteatose hepática. E eu vou falar um pouquinho mais a respeito disso. daqui a pouco. Então hoje a gente tem um panorama de mutações dos pacientes com mutações da telomerase, que é bem diferente do panorama inicial que a gente tinha. Dois alunos de mestrado, o Gustavo e o André, junto com a Bárbara, que é a gerente do nosso laboratório. e também junto com a Fernanda, elas conseguiram sequenciar vários dos pacientes, a maioria dos nossos pacientes com disceratose congênita ou anemia plástica no laboratório, usando a curva normal que a Fernanda havia estabelecido por Flowfish. Então a gente consegue aqui ver algumas características. Primeiro que esses aqui são os pacientes que têm disceratose congênita, estão aqui até os 20, 25 anos, todos têm invariavelmente telômeros muito curtos. E na maioria desses pacientes, o André e o Gustavo conseguiram identificar mutações nesses pacientes. Só que uma porcentagem deles, que aqui são quatro ou cinco, eles não conseguiram identificar nesse panorama de genes que foram sequenciados e aqui que está uma fonte de interesse, porque podem ser que existam outros genes relacionados à biologia dos telômeros que nós desconhecemos ainda e que isso pode... conseguir identificar outros genes que estão envolvidos nessa via de reparo do DNA, especificamente de reparo dos telômeros. Já nos pacientes com anemia plástica, cada ponto aqui preto é um paciente, você vê que só uma minoria dos pacientes vão estar abaixo do percentil 1. E aqui é um pouco mais difícil a gente identificar mutações. Você vê que de um número razoável de pacientes, eles conseguiram identificar mutações em TINF2 e em TIRT, só em TIRT. três pacientes. Você vê que existe uma diferença, primeiro, do comprimento telomérico, não são todos os pacientes com anemia plástica que têm uma alteração dos telômeros, ao contrário da disceratose congênita, mas mesmo entre aqueles que têm telômeros curtos, o perfil genético é um pouco mais complexo e você vê que ele é um pouco mais reduzido. Aqui mutações em TURT e TURT, enquanto aqui você tem mais genes envolvidos nesse processo. E dentre essas mutações, então são vários genes que eles colocaram aqui, eu vou chamar a atenção para uma mutação no RTEL1, que é uma mutação nessa região que só está expressa em uma das isoformas, que é a isoforma 3, que é essa região aqui do ring domain dessa helicase, que é o RTEL1, e a Fernanda agora, enquanto ela está no NIH, ela identificou, essa aqui foi a primeira mutação descrita ou identificada nessa região do RTEL1, e ela encontrou numa... Em uma coorte de pacientes lá do NIH, americanos, também uma mutação muito próxima, numa região muito próxima, e ela fez um plasmídio contendo essa mutação para entender melhor o que essa mutação faz com o RTL-1. Então, enquanto no plasmídio selvagem você tem uma colocalização entre esse RTL-1, entre essa helicase e os telômeros em si, aqui representados, pela shelterina TERF2, naquelas células que foram transfectadas com o Arteon mutante, eles não se localizam. Esse ring domain, ela mostra funcionalmente que essa mutação faz com que essa helicase perca a sua capacidade de se ligar aos telômeros e, portanto, ter a sua função de resolver essas estruturas. Como eu disse, existe um painel muito largo de mutações que acontecem nessas doenças, é bastante heterogêneo e a manifestação clínica é heterogênea. Eu disse, tem anemia plástica, febrose pulmonar, cirrose hepática, também esses pacientes têm um risco muito aumentado para desenvolver leucemia aguda e tumor de cabeça e pescoço. E é difícil a gente entender o porquê que é tão variada a expressão. o fenótipo dessas doenças. Para tentar identificar isso, a gente havia desenvolvido algumas células pluripotentes, tronco pluripotentes induzidas, a partir de fibroblastos de pacientes com mutação da telomerase. E eu vou chamar a atenção aqui só para esse par de irmão e irmã. Essa irmã aqui tinha anemia plástica, ela tinha essa mutação que incluía o stop codon. nesse códon 889 e o irmão dela que tinha uma medula hipocelular, mas ele era completamente normal e na verdade isso aqui deve ter, a primeira identificação deve ter mais ou menos uns 8 anos e esse irmão continua completamente bem obrigado. E quando a gente desenvolveu as células IPS desses indivíduos, primeiro aqui são dos indivíduos saudáveis, E essa aqui são os fibroblastos parentais, você vê que à medida que tem passagem tem um encurtamento dos telômeros, mas dos cromossomos você vê que existe um alongamento dos telômeros, porque essas células expressam muita telomerase a partir da reprogramação celular. Só que dos pacientes com a mutação, você tem um certo alongamento, outros não, mas você vê que é muito deficiente esse alongamento telomérico por conta dessa deficiência. Isso a gente pode ver um pouco melhor nesse gráfico. Aqui são os dois indivíduos saudáveis e aqui são os pacientes com mutação. Isso é cerca de 50% só de alongamento do que se prevê no indivíduo saudável. Mas o que eu queria chamar a atenção de vocês é esse par de a irmã aqui e aqui o irmão. Embora eles tenham exatamente a mesma mutação, esse indivíduo tem muito mais alongamento do que essa irmã. que tem um alongamento muito inferior. E isso reflete exatamente o que eles têm clinicamente. Essa irmã aqui tem anemia plástica, depende de transfusão, foi tratada, etc. E ele aqui vai muito bem obrigado, embora tenha uma medula óssea hipocelular. Então existe alguma correlação aqui, sugerindo que outros fatores, ou genéticos ou epigenéticos, possam estar relacionados a isso. Por outro lado, a Flávia, ela conseguiu desenvolver... Células IPS a partir de fibroblastos de um paciente nosso com mutação no gene DKC1 e o painel aqui, o perfil é totalmente diferente do que a gente tinha visto daquele outro caso da mutação da telomerase. Nenhum dos clones desenvolvidos, eles conseguem manter o comprimento telomérico. Pelo contrário, você tem uma redução do comprimento telomérico muito grande. Só que existe uma coisa que ela está tentando entender, e a gente não sabe exatamente o que acontece, é que a partir de um determinado momento isso mais ou menos se estabiliza. E esses clones estão aí na passagem 80, 100, não morreram, não desapareceram, eles mantêm um comprimento telomérico muito longo, eles não melhoram o telômero, mas também não pioram, eles continuam estáveis. Então existe alguma coisa que está acontecendo nessas células aqui, a partir de um determinado ponto, em que eles conseguem manter a sua proliferação, eles não se diferenciam, mas também não tem um alongamento telomérico como a gente preveria. Então esse é um ponto, é uma interrogação e o que ela está tentando identificar é o que pode estar mantendo os telômeros nessas células, sendo que eles não são para ser mantidos. durante a passagem em células IPS. Mas voltando àquele par de irmão e irmã que eu havia falado anteriormente, quando a gente olha a expressão de TURT e TURC durante a diferenciação, você vê que o irmão tem mais expressão de TURT do que a irmã. Então esse processo se mantém, isso em três clones diferentes, independentes, e se correlaciona com o fenótipo. E quando a gente induziu a diferenciação hematopoética, a mesma coisa acontece. Vamos olhar aqui. O irmão conseguiu formar muito mais colônias hematopoéticas a partir das IPS do que a irmã. Então, esse é um fato que pode indicar pra gente que existem outros fatores aí que colaboram pro fenótipo e desenvolvimento da doença, ou modulam a penetrância dessa mutação nesses pacientes. Por outro lado, a Florencia, ela ficou interessada em olhar o que acontece naqueles pacientes com anemia plástica que tem telômero normal. A gente é capaz de fazer células IPS desses pacientes e ela usou uma técnica técnica diferente, em colaboração com a Lígia Pereira daqui do CTC, mas em São Paulo, a partir de eritroblastos. E ela conseguiu formar várias colônias, um número fenomenal de colônias, mesmo em pacientes saudáveis, em relação aos controles. E esses pacientes aqui conseguem alongar os telômeros razoavelmente bem, embora algumas colônias não tenham o mesmo sucesso. Mas isso pode servir para a gente agora? de plataforma para poder entender os mecanismos de diferenciação hematopoética e os mecanismos imunes que acontecem na anemia plástica adquirida. Mas aqui o nosso interesse maior é justamente nessa heterogeneidade do fenótipo dos pacientes. E a Raquel, que foi pós-doc, agora está no nosso laboratório, agora está no Albert Einstein. e mais recentemente o João Paulo, que é aluno de doutorado, eles colocaram aqui uma série de pacientes, todos com mutação, a maioria de uma mesma família, mas você vê que uns têm telômero muito curto, outros têm a mesma mutação, mas o telômero é razoavelmente longo e não tem doença, e tentou olhar o que tem de diferente entre esses indivíduos que estão em azul e os indivíduos que estão em vermelho. E uma das coisas que ela quis olhar... foram nas helicases. Como eu tinha dito, as helicases elas resolvem, são um conjunto de proteínas que resolvem estruturas do DNA. Em especial, tem duas coisas em que o ARTEL1 está envolvido, que é a resolução de G quadruplexes, porque tem muito G na estrutura. TTA-GGG, isso forma estruturas quaternárias no telômero, que precisam ser resolvidas durante a divisão celular. Tanto o RTEL-1 quanto as proteínas de Werner e Blum, que são duas proteínas causadoras de doenças de progérias, doenças progeróides, resolvem essas estruturas. O João Paulo conseguiu identificar usando um anticorpo. Essas estruturas quaternárias que reconhecem especificamente isso em linhagens celulares. E a Raquel havia observado que tanto a WRN, o Werner, quanto a proteína de Bloom, elas têm uma expressão menor quanto mais curtos os telômeros. Então pode ser que essas sejam alterações das helicases, sejam outros fatores que contribuam para o fenótipo desses pacientes. E o João Paulo, ele então analisou uma série de helicases e uma série de pacientes e viu que aqueles pacientes que têm os telômeros mais curtos, eles se clasterizam aqui, que têm uma expressão menor de helicases, em relação a indivíduos saudáveis ou alguns pacientes que têm mutação, mas eles não têm o fenótipo da doença. Então, provavelmente, essas helicases estão contribuindo para a manifestação dessa doença. A Raquel também havia olhado num grupo grande de proteínas relacionadas ao câncer, de acordo com o PCR lá da QIAGEM, mas é uma série de proteínas e ela conseguiu observar que aqueles indivíduos que têm o telômero normal, embora eles tenham a mutação, eles têm um padrão de expressão muito parecido com os indivíduos saudáveis, que são da mesma idade, por exemplo, para ATM, VEGFA. mas que aquelas que tem o telômero curto, você vê que tem uma expressão bastante distinta dos pacientes. Sugerindo então que você tem a ativação ou desligamento de uma série de outros genes que podem influenciar nesse fenótipo. Como que a gente trata esses pacientes? Então esse aqui é um gráfico de uma paciente enquanto eu ainda estava no NIH, que ela fez por conta própria na década de 90, que ela tinha anemia plástica, que ela tem uma mutação. no sítio da transcriptase reversa e ela foi tratada pelo hematologista dela lá na Pensilvânia com Deca-Durabolin, aqueles que já foram à academia alguma vez já devem ter ouvido falar. E aqui é o gráfico que ela fez do hematócrito dela e que mostra que houve uma resposta muito boa com o uso do Deca-Durabolin. E a gente sabe desde a década de... Na década de 60, por trabalho do professor Sanchez Medal, na cidade do México, que esteroides anabolizantes têm um efeito positivo em uma porcentagem menor de pacientes com anemia plástica. E o que a gente viu no laboratório agora, quase, sei lá, 40 anos depois, é que os hormônios sexuais, eles estimulam a atividade da telomerase e isso faz com que... Algumas existem regiões responsivas ao estrógeno na região promotora do gene TERT. Então, se tratar essas células com andrógeno ou estrógeno, fazem com que se liguem ao receptor alfa, se não me engano, e aumentem a expressão do gene e aumenta a telomerase. Baseado nesses achados, ainda quando eu não tinha vindo para Ribeirão Preto, ainda estava indo na EIT, a gente desenhou um estudo que... Acabou sendo publicado agora, recentemente, há alguns meses, que a gente recrutou 27 pacientes com mutações da telomerase, que tinham doença dos telômeros, e o endpoint primário era o comprimento telomérico no sangue periférico. E o que a gente vê, de forma que foi bastante impressionante, é que, primeiro, essa linha aqui é o que a gente esperaria com a idade de encurtamento telomérico para indivíduos saudáveis. E esse aqui é o encurtamento que a gente esperaria ver nos indivíduos com mutação baseado em dados prévios do que existe de encurtamento nesses indivíduos. Mas o que a gente viu foi o oposto nesses pacientes tratados com o danazol. Então eles foram tratados com o danazol, que nos Estados Unidos não tem o decadobrubolim, que foi abolido, mas você vê que existe um alongamento tempo dependente desses telômeros. O estudo foi desenhado para dois anos e depois que esses pacientes saíram, Do estudo, você vê que há um encurtamento bastante significativo, eles voltam quase para o que era esperado para eles. Então, tem uma queda muito grande, mostrando que o uso desses hormônios pode promover um alongamento telomérico, pelo menos nesses pacientes. Isso se correlaciona com uma melhora das contagens do sangue periférico e uma estabilidade, pelo menos, da função pulmonar. Alguns desses pacientes tinham fibrose pulmonar. E a gente conseguiu ver uma estabilidade da função pulmonar desses pacientes durante o tratamento. Aqui no Hemocentro, no Ambulatório de Falências Medulares, a gente tem um estudo bastante semelhante, que é conduzido pelo Diego Clé, que é financiado pelo CNPq, D-City e pelo próprio CTC, usando... o Decadorabolin, a nandrolona, para o tratamento desses pacientes. Nós temos já, se não me engano, 12 pacientes recrutados, eles não usam uma dose muito grande. O objetivo é recrutar 20 pacientes e dos dados que a gente tem até o momento, ao contrário do uso do danazol, nenhum paciente precisou parar o uso da medicação por conta de toxicidade, isso é importante. E os dados que a gente tem é que houve uma melhora. das contagens do sangue periférico, mas a gente não tem ainda os dados do comprimento telomérico com o uso da nandrolona, tem um ou dois pacientes, mas ainda é muito pouco pra gente poder falar alguma coisa. Em penúltimo lugar eu queria falar sobre as alterações do fígado e esses pacientes acabam desenvolvendo cirrose hepática, esteatose hepática e a gente não entende muito bem porquê. Então a Raquel ainda quando ela estava aqui no postdoc, ela usou camundongos que são nocaute para telomerase, tanto para enzima em si, quanto para o componente de RNA, que é o TURK, e ela tratou esses camundongos com o experimento Super Size Me, que é o McDonald's, ela dava uma dieta rica em gordura durante 15 dias para esse paciente, praticamente eles iam comer no Burger King todos os dias. E o que ela viu foi que aqueles camundongos que estavam submetidos à dieta hiperlipídica, que só aqueles que eram deficientes da enzima telomerase mostraram alterações muito significativas que a gente pode ver mais claramente nesse slide, que é uma esteatose hepática. Muito intensa. Então aqui você vê que esses blobs brancos aqui é a gordura que se acumula depois de 15 dias, que a gente pode ver nessa coloração aqui e aqui também por body pie que a gente consegue ver uma esteatose intensa depois de 14 dias nesses camundongos, o que não aconteceu nem no wild type, no selvagem, nem no deficiente do turkey. Tratou esses camundongos com a ZT, que é a zidovodina, que é o inibidor de transcriptase reversa, e ela conseguiu ter exatamente esse mesmo fenótipo nesses camundongos que são deficientes de TURC, mas não nos selvagens. Sugerindo então que é uma atividade da enzima transcriptase reversa, ou uma deficiência dessa enzima que causa esse fenótipo. E ela fez uma análise do metaboloma dessas células e aqui tem um conceito bastante interessante, eu vou gastar um pouquinho mais de tempo nisso, mas ela avaliou todo o metaboloma. Então vamos olhar aqui, esses aqui são os indivíduos selvagens com dieta regular. E eles estão mais ou menos nesse eixo aqui, em PC1 e PC2. Quando ela tratou esses camundongos selvagens com a doença hiperlipídica, tem um pequeno... deslocamento do perfil metabólico desses animais, um pouco aqui para a esquerda no PC1, mas é mais ou menos isso. Os camundongos Turkey Knockout, eles estão aqui, são muito diferentes para o começo de conversa, o perfil metabólico deles. Só que os animais Turkey, quando eles são tratados com dieta hiperlipídica, eles conseguem responder de uma forma adequada ou semi-adequada à mudança. da alimentação, a dieta hiperlipídica. Enquanto os camundongos que são deficientes de TURT, quando eles são submetidos à dieta hiperlipídica, praticamente continua a mesma coisa o perfil metabólico deles. Diria que possa existir um termo que eu vou falar aqui que não é exatamente padrão, mas é uma senescência metabólica. Ele é incapaz de responder metabolicamente a uma mudança da dieta. Então, a primeira coisa que a gente quer saber é se isso acontece, isso aqui é em Camundongo, se isso acontece nesses pacientes também. Então, a Lilia, no laboratório, ela está desenvolvendo, ela desenvolveu algumas células IPS de eritroblasto, de fibroblasto da pele, de pacientes com mutações, aqui é um exemplo de mutações no gene TURC, e ela conseguiu várias colônias com os marcadores todos. E ela agora está desenvolvendo, fazendo a diferenciação hepática desses IPS, para a gente poder ter hepatócitos desses pacientes e poder jogar lipídio ali no hepatócito e saber se a gente consegue reproduzir o mesmo fenótipo que a Raquel havia observado em camundongos. Finalmente, existe uma, como vocês podem imaginar... Essa manutenção dos telômeros é muito importante para células cancerosas, para neoplasias. A gente já tinha visto que esses pacientes podem desenvolver LMA, mielodisplasia, mas um outro ponto que eu queria falar aqui é que mais recentemente foram identificadas mutações adquiridas na região promotora do gene TURT em pacientes, seja com melanoma, no caso desse do melanoma era uma mutação que ocorreu no organismo. familiar, em caso de uma história familiar de melanoma, e que eles identificaram a mutação constitucional, mas em outros casos são mutações adquiridas, e a célula neoplásica adquire mutações em duas regiões da região promotora do gene TERT, e que isso é a mutação em região não codificante mais comum em tumores e neoplasias atualmente. E a Raquel havia conseguido, pela primeira vez, ela analisou em células linfóides. E ela olhou em linfomas das células do manto, que é um tipo de linfoma bastante agressivo, que normalmente se leucemiza e o paciente, infelizmente, morre muito rapidamente, porque o tratamento não é efetivo. E ela observou também em outras neoplasias linfóides, que não o manto, mas de células B, principalmente. leucemizadas, para tentar identificar mutações nessa região promotora. Só que ela identificou apenas essas mutações em indivíduos com linfoma de células do manto, que é mais agressivo, e não teve nenhuma mutação nas outras neoplasias linfóides. Essas mutações estão nessas regiões aqui. por Sanger, especificamente, e ela demonstrou pela primeira vez que essas mutações estão associadas na célula leucêmica a um aumento da expressão de TURT. Então TURT é mais expresso naqueles que tem mutação do TURT, esses acoloridos aqui são os casos que são homozigotos para mutação, e esse é uma mutação, esse outro, mas em média existe um aumento da expressão da telomere. telomerase em relação àqueles não mutantes e os telômeros tendem a ser um pouco mais longos, mas isso não é tão significativo. Então, e essas mutações adquiridas podem ser um mecanismo adquirido de células neoplásicas que aumentam a sua agressividade e que o tratamento que explore tenha como alvo a inibição dessa via podem ser interessantes nesses pacientes. E por último, a gente achava antes que os telômeros não sequenciam nada, eles são uma sequência, meio uma borracha na ponta dos nossos cromossomos, que servem para ser desgastada, mas na verdade não é bem assim. A região telomérica também é transcrita, e ela é transcrita nesse RNA, que é um RNA longo não codificante, que é chamado de terra. E ele, então, a sequência de terra, ela começa na região subtelomérica e depois tem regiões, ela tem sequências de UAA, GGG nela, e você tem essas várias sequências que são produzidas na ponta dos cromossomos. Aparentemente, alguns trabalhos mais recentes sugerem que o terra do cromossomo 20Q, talvez seja mais importante na regulação, mas isso a gente precisa entender melhor. alguns têm pontas poliar, e a gente está começando a entender o que a Terra faz. Aparentemente, eles têm alguma função, tanto de promover o alongamento telomérico, recrutar a telomerase para o sítio, para os telômeros, para facilitar o alongamento, assim como inibir o alongamento telomérico. É uma função, funções paradoxais, e é bastante complexa a sua atuação, mas é um ponto... É muito interessante da fisiologia telomérica e eles podem também atuar distalmente inibindo a expressão de outros genes, que não na região telomérica. E o Leonardo, no laboratório, ele olhou, não existe praticamente nenhuma informação sobre a expressão de terra em células humanas saudáveis, normais ou doentes. Quase tudo é em camundongo ou em levedura. ou em linhagens celulares. Então a primeira coisa que ele fez foi explorar em sangue e medula óssea de sangue de indivíduos saudáveis. Existe uma expressão maior de terra, ele olhou três regiões diferentes, 15Q, 10Q e XQ e YQ, mas você vê que existe uma expressão maior na medula óssea em relação ao sangue periférico. Mas nessa abordagem exploratória, uma das coisas muito interessantes que... O Leonardo observou é que terra é altamente expresso em casos de leucemia meloide aguda, o que não acontece, por exemplo, em casos de leucemia linfóide aguda, que praticamente você não tem nenhuma expressão de terra nesses casos, de nenhum desses terras diferentes, de cromossomos diferentes. E agora ele está tentando entender o que é esse padrão, se essa expressão de terra está associada a algum subtipo específico de LMA. Por que existe essa diferença entre LMA e LLA? E se essa expressão de terra está colaborando para o alongamento telomérico nas leucemias meloides agudas? Se ela é um epifenômeno ou se isso participa ativamente da manutenção ou da malignidade da LMA? Quando a gente olha, é interessante que quando você clasteriza a expressão desses três diferentes terras, mais o comprimento telomérico, os casos de LMA, eu acho que cortou aqui um pouquinho, mas eu acho que esse aqui é o comprimento telomérico. Quando você coloca os três terras mais o comprimento telomérico, você consegue clasterizar especificamente todos os casos de LMA e separá-los, se de outros tumores ou do sangue normal. Então... Esses são dados bastante recentes, mas tem informação muito interessante de como o reparo e a manutenção dos telômeros podem contribuir para entender na carcinogênese, em especial nas neoplasias hematopoéticas, e como isso pode, de alguma forma, ser alvo terapêutico para o tratamento dessas doenças. Eu já mostrei quase todo mundo, acho que foi faltando... Se não me engano, duas pessoas, o Gustavo dessa vez eu não esqueci de mencionar, mas ficaram duas pessoas, faltando uma é o Pedro Padilha, que trabalha em uma outra área que não é exatamente telômero, e o Pedro Prata, são os Pedros que trabalham com hemoglobinúria paroxística noturna, então eles não citei. o citei aqui especificamente no trabalho, mas eu queria agradecer também os colaboradores aqui na faculdade, o Badini, que é da pneumologia, e a Ana Martinelli, da hepatologia, alguns colaboradores na Argentina, na Academia Nacional de Medicina, a Irma Slavutsky, nesse trabalho dos linfomas e mielomas também que a gente tem feito, e a minha casa anterior no NIH, no NIH. Em especial ao Niel, que tem recebido vários dos meus alunos lá no NIH. E atualmente, acho que tem uma, só a Fernanda, né? Fernanda atualmente está lá, mas vários outros já passaram lá. Obrigado, estou aberto a perguntas.

justamente os telômeros, as pontas, como a gente pode ver aqui em amarelo, dos nossos cromossomos. Acho que muitos de vocês já ouviram eu falar, mas só para lembrar de que os nossos cromossomos, eles são lineares e isso aconteceu em algum momento durante a evolução, em que desde que a gente deixou de ser bactéria e deixou de ter o DNA circular, como acontece nos plasmídeos. O nosso DNA passou a ser linear, isso trouxe várias vantagens para a célula do ponto de vista de recombinação de material genético, que facilita muito provavelmente a recombinação de material genético durante a meiose, então é uma vantagem por essa razão.

Por outro lado, ela impõe um problema à célula durante a divisão mitótica. Então existe esse problema. Desbalanço entre as vantagens meióticas da célula e as desvantagens mitóticas da célula.

Isso porque dentro da célula, uma molécula de DNA ou cromossomo tenta esconder as extremidades de uma molécula de DNA, as extremidades 5'e 3'da molécula de DNA. Porque elas normalmente são reconhecidas pela maquinaria de reparo do DNA, como um DNA lesado ou um DNA infeccioso, como por exemplo o DNA de um vírus. E a maquinaria de reparo do DNA, na maioria das vezes por recombinação de ponta não homóloga, tenta recuperar ou reparar. essas pontas, extremidades 5'e 3'do DNA.

Então, quando a nossa molécula deixa de ser linear, que não tem ponta nenhuma, ela passa a ser, deixa de ser circular e passa a ser linear, isso faz com que a molécula tenha que esconder essas extremidades 3'e 5'da molécula do nosso cromossomo para que isso não ative a maquinaria de reparo do DNA. E para isso, os nossos cromossomos têm uma estrutura bastante complexa, que é ribonucleoproteica, ou seja, existe a parte de nucleotídeos, que é justamente essas sequências repetidas de TTAGG, que fazem uma estrutura como um nó, um laço na ponta dos nossos cromossomos, que é esse tilupe que a gente está vendo aqui no slide, que, como são sequências repetidas... A ponta dos nossos cromossomos, ela é assimétrica, a extremidade 3 linha da fita líder, ela é mais longa do que a extremidade 5 linha da fita complementar. De tal sorte que existe uma pequena extremidade, uma pequena ponta que é de fita simples. Isso permite que essa ponta de fita simples, ela se dobra de volta sobre a sequência repetida e ela...

se anele com a mesma sequência de TTA, GGG e faz com que a gente tenha essa volta, um nó na ponta dos nossos cromossomos. Além disso, essa sequência TTA, GGG é reconhecida especificamente por uma série de proteínas, diretamente pelo menos por duas, que são TURF1 e TURF2, que a gente está vendo ali. que reconhecem a dupla fita de TTA-GGG e pelo menos uma outra proteína que reconhece a fita simples de TTA-GGG que é a POT1. que está representada aqui.

E essas proteínas, então, têm a função de cobrir ou dar abrigo a essa estrutura de nucleotídeos e esconder essa estrutura da maquinaria de reparo do DNA. Se você, por algum mecanismo exógeno, faz um knockdown ou deleta, silencia alguns desses genes aqui, em especial o TIF2 ou o TIRF1, TIRF2, TPP1, por exemplo, você expõe na célula essas extremidades e imediatamente você vai ver uma recombinação, uma junção ponta a ponta dos cromossomos da célula. Isso é fácil de fazer no laboratório, demonstrando a importância de cada uma dessas proteínas e a importância dessa estrutura que existe na ponta dos nossos cromossomos. Esse é então um dos problemas que existem quando... Foi a evolução escolheu o cromossomo linear, ou que essa estrutura linear dos cromossomos surgiu como um benefício.

Mas o outro malefício é que a DNA polimerase, ela não é capaz de replicar completamente a ponta dos nossos cromossomos. É por isso, essa é uma das razões que você tem essa assimetria entre a extremidade 5'e 3'. Isso por conta de uma inabilidade característica da DNA polimerase, sobre o qual não vou entrar aqui muito em detalhes, mas que foi reconhecida por um biólogo teórico na Rússia, mais especificamente em Moscou, na década de 70, de que a DNA polimerase não tem essa capacidade de duplicar a ponta. totalmente dos telômeros, o que faz com que inevitavelmente em toda duplicação mitótica a fita recém-sintetizada vai ser mais curta do que a fita molde.

Então isso leva a o que ele chamou de marginotomia, que é o corte das margens ou problema da replicação das pontas. Isso faz com que inevitavelmente os nossos... Telômeros, e aqui é uma medida dos telômeros, isso em leucócitos do sangue periférico, desde o cordão umbilical até a nona ou décima década de vida em humanos, em indivíduos saudáveis, faz com que os nossos telômeros se encurtem à medida que a gente envelhece. Esse é um grupo de mais ou menos 200 indivíduos saudáveis.

medidos, esses aqui no caso, por uma técnica que é o QPCR, mas existem várias formas de a gente determinar isso. Para que a gente pudesse analisar melhor essa forma, a dinâmica do comprimento telomérico, aqui na FMRP, a Fernanda Gutierrez, que na época era aluna de mestrado, e hoje aluna de doutorado, está fazendo parte. Um sanduíche do doutorado no NIH no momento, ela desenvolveu uma técnica que é o Flowfish, que é uma combinação de citometria de fluxo junto com a hibridização in situ, de uma população de mais ou menos 200 doadores saudáveis, a maioria aqui são doadores do hemocentro, doadores de sangue aqui do hemocentro, mas existem também crianças saudáveis e alguns indivíduos mais idosos saudáveis, o Dimas está mais ou menos...

por aqui, olha. E você vê que, em comparação à curva anterior, existe mais ou menos uma constante dessa curva, e eu vou mostrar outras curvas feitas em outros locais que seguem o mesmo padrão, que ela tem uma equação de terceiro grau, tem um polinomial de terceiro grau, que você vê que tem uma... Redução mais rápida durante as primeiras duas décadas de vida, isso fica mais devagar durante a vida adulta e depois aqui dos 70 anos mais ou menos, isso volta a acelerar o encurtamento telomérico. Mas a gente fazer isso mais ou menos como uma constante, a equação da Fernanda é de que a gente perde cerca de 47 pares de base por ano.

Nessa outra curva que eu tinha feito no laboratório antes, que dava 52 pares de base por ano, que é o número que eu gosto mais, porque dá um par de base por semana. Mas é mais ou menos a mesma coisa. Então você vê que existe uma dinâmica e um padrão do encurtamento telomérico entre os diversos indivíduos. Isso é fundamental. Então, para a gente entender o que acontece em diversas doenças.

Algumas das nossas células, elas precisam, portanto, você pode imaginar que se isso acontecesse indefinidamente, não só a humanidade como a vida com cromossomos lineares desapareceriam da superfície da Terra, porque os cromossomos iam escurtando até que eles desapareceriam. Para evitar que exista esse encurtamento telomérico, ou... indefinido, algumas células em algum momento da evolução também, provavelmente incorporaram algum vírus no material genético que continha uma transcriptase reversa, que a gente chama de telomerase ou TERT, que está representada aqui por essa bola laranja. A telomerase é uma transcriptase reversa, cujos sítios da transcriptase em si são muito conservados e muito semelhantes, por exemplo, à transcriptase reversa do HIV. Por isso que...

A ideia é que isso provavelmente tenha sido a incorporação de algum vírus de RNA, que tem transcriptase reversa, que possa ter dado essa capacidade às nossas células. E a telomerase, ela usa uma molécula de RNA, que aqui é representado por esse TURC, que serve como molde para estender a extremidade 3'dos nossos cromossomos. Só que esse complexo da telomerase, ele é expresso a... apenas em algumas células muito específicas, que têm uma capacidade muito alta de proliferativa, sejam as células troncoembrionárias ou as células troncoadultas, como as células troncoematopoéticas, que nos interessam mais, mas também algumas outras células que têm alta proliferação, como os linfócitos ativados, sejam linfócitos T, linfócitos B, e cerca de 90% dos... Diferentes tipos de cânceres também super expressam a telomerase como um mecanismo de dar capacidade proliferativa às suas células.

Mas não é só a telomerase, o TERT e o TURC que são importantes, vocês veem que existem várias outras proteínas que estabilizam esse complexo e dentre elas eu vou destacar aqui a diserina, porque ela fica no cromossomo X e tem uma importância clínica muito grande. Mas existem outras estruturas como aquelas proteínas da xelterina, sobre as quais eu havia falado anteriormente. E existem outras proteínas como a helicase RTL1, por exemplo, que ela é fundamental para desfazer aqui o nó do tilup e desfazer algumas estruturas que existem na região dos telômeros.

Ela resolve várias dessas estruturas e eu vou falar a respeito disso daqui a pouco. O encurtamento excessivo dos telômeros, eles levam, como vocês podem imaginar, a uma parada proliferativa, uma senescência proliferativa das células. A célula para de proliferar quando os telômeros são muito curtos. E isso foi inicialmente detectado num tipo de falência da medula óssea, um tipo de anemia plástica congênita chamada de ceratose congênita, que foi descrita acerca de...

Uns 100 anos aproximadamente, por conta dessa tríade dessas alterações nas unhas, que parece que tem uma micose na unha, tem essas alterações na pele aqui, que também parece uma micose de piscina. E existem essas leucoplasias, que são essas manchas brancas na língua, na bochecha interna da pessoa. Então essa tríade chama disceratose porque tem uma alteração da queratina. Disceratose ou disqueratose. E inicialmente o grupo do Inderjet-Dokal, na época ele estava no Hospital Hummersmith em Londres, ele conseguiu numa família, isso atinge algum dos padrões de herança da disceratose congênita, é ligado ao X, e em uma dessas famílias, que acometia apenas meninos, ele conseguiu numa época pré-histórica, na década de...

final da década de 90, que não existia muito sequenciamento, você fazia análise de linkage e ficava fazendo um monte de salvemblote para achar onde está isso, onde está aquilo, um trabalho interminável, tedioso, incompreensível, e que eles conseguiram localizar uma região no cromossomo X ligada à doença nessa família. encontraram um gene, isso quando toda essa bioinformática que a gente tem hoje ainda era rudimentar, provavelmente você precisava colocar CD ou flop disc no computador para poder reconhecer as sequências, e chamaram o gene que existia nessa região. região de DKC1 de serina. E na época não se sabia exatamente o que que essa proteína exatamente fazia, se imaginava que ela pudesse estar relacionada à função de ribossomos, ribossomos estavam bastante na moda na época, mas um ano depois, uma pesquisadora de Stanford, a Kathy Collins, que trabalhava com a biologia de telômeros, Ela demonstrou que, na verdade, essa discerina, que é aquela proteína que eu mostrei anteriormente para vocês, não tinha, pelo menos, nenhuma importância nos ribossomos, mas, efetivamente, ela fazia parte do complexo da telomerase em vários estudos, mostrando, então, que o papel essencial da discerina é dar estabilidade ao complexo da telomerase.

Como esse gene fica no cromossomo X, Os meninos que têm uma mutação nesse gene, nessa proteína, portanto, têm uma deficiência praticamente absoluta da discerina e têm um fenótipo bastante intenso, mas o que causa a morte, infelizmente, dessas crianças não são essas alterações da pele, mas a medula óssea desses pacientes para de funcionar. Aqui nós temos uma imagem. de uma biópsia de medula óssea de um indivíduo saudável, em que a gente tem as trabéculas ósseas e por dentro, então, o conteúdo hematopoético da medula óssea, e essa é a medula óssea de um paciente com anemia plástica, seja congênita, seja adquirida, em que você pode ver que o tecido hematopoético é substituído por gordura. E existe uma diferença fundamental aqui, nessa aplasia, em que ela é substituída por gordura na anemia plástica, de, por exemplo, na aplasia que acontece em um paciente que recebe quimioterapia ou um paciente que recebe radioterapia.

Ele também vai ter uma certa aplasia, mas ela não vai ser necessariamente substituída por gordura. Mas, mais do que isso, no indivíduo que recebe quimioterapia e radioterapia, as células-tronco e progenitoras hematopoéticas, elas permanecem intactas. Ou, na grande maioria delas, elas não são atingidas. pela radioterapia, em especial aquelas que estão em G0. Então, a partir de um determinado momento, elas conseguem recuperar, que você não tem mais a ação da rádio, da quimioterapia, elas conseguem recuperar a celularidade na medula e a hematopoese.

Ao contrário do que acontece aqui, tem que você ter uma profunda deficiência das células tronco e progenitoras hematopoéticas, que levam, então, à aplasia dessa medula óssea. E a gente já sabia mais ou menos da mesma época em que pacientes de anemia plástica tinham uma progressão, um encurtamento telomérico, só que isso ainda era duvidoso se isso era uma causa ou um efeito da anemia plástica. E esse trabalho da Kathy Collins juntou as peças do quebra-cabeça e mostrou que, na verdade, esse encurtamento dos telômeros... provavelmente, pelo menos na disceratose congênita, era uma causa da doença.

Um defeito genético que leva a um defeito da telomerase, encurtamento dos telômeros e isso faz com que você diminua a proliferação da célula tronco-hermatopoética. Diante disso, a gente foi procurar, então, um grupo maior de pacientes com anemia plástica. aparentemente adquirida, não aqueles casos de ceratose congênita, que não tem aquelas alterações da unha, nenhuma alteração dermatológica, se eles tinham mutação no gene da telomerase, especificamente, que fica em um cromossomo autossômico.

E o que nós identificamos foi que esses pacientes, nós encontramos cerca de um pouco mais de uma meia dúzia de pacientes héteros e gotos para a mutação. da telomerase, então eles têm cerca de 50% da telomerase funcional. E o que é interessante é que eles tinham uma certa história de familiar de mielodisplasia ou de leucemia mieloide aguda. E esses pacientes aqui é uma outra curva do Canadá, também por flowfish, cada ponto amarelo é um indivíduo saudável lá, canadense.

Mais ou menos o que é importante é que vocês vão ver que a forma, esse shape da curva permanece. independente da população que você olha. Mas esses pacientes com anemia plástica e mutação da telomerase tinham telômeros muito mais curtos do que a população em geral, mostrando que você tem essa mutação, leva a uma deficiência da enzima, da transcriptase reversa e um encurtamento excessivo dos telômeros.

Então, do ponto de vista meu, que sou hematologista, a anemia plástica a gente conseguiu linkar ou associar Do ponto de vista causa e efeito, muito bem a deficiência da telomerase, mas como havia dito, existem outras doenças que posteriormente, eu não vou entrar muito em detalhes aqui, que também estão associadas a esse defeito genético. E na verdade são vários defeitos genéticos, e hoje a gente tem uma visão muito mais complexa e interessante desse defeito. genético, levando a uma alteração do mecanismo fundamental da célula, que é a manutenção do comprimento telomérico que acontece em cada uma das nossas células, mas mutações de uma série de genes diferentes envolvidos na manutenção dos telômeros podem causar essa doença.

A disceratose congênita é o caso mais extremo da doença dos telômeros. Esses pacientes, invariavelmente, têm telômeros muito curtos. Essa doença, primeiro, que a gente conseguiu associar é anemia plástica, mas com base no perfil, tanto dos próprios pacientes, quanto de familiares, a gente conseguiu observar que isso também estava associado à fibrose pulmonar idiopática ou à fibrose pulmonar familiar, eu não vou falar muito a respeito disso hoje, mas também à doença hepática, em especial cirrose hepática e esteatose hepática. E eu vou falar um pouquinho mais a respeito disso. daqui a pouco.

Então hoje a gente tem um panorama de mutações dos pacientes com mutações da telomerase, que é bem diferente do panorama inicial que a gente tinha. Dois alunos de mestrado, o Gustavo e o André, junto com a Bárbara, que é a gerente do nosso laboratório. e também junto com a Fernanda, elas conseguiram sequenciar vários dos pacientes, a maioria dos nossos pacientes com disceratose congênita ou anemia plástica no laboratório, usando a curva normal que a Fernanda havia estabelecido por Flowfish. Então a gente consegue aqui ver algumas características. Primeiro que esses aqui são os pacientes que têm disceratose congênita, estão aqui até os 20, 25 anos, todos têm invariavelmente telômeros muito curtos.

E na maioria desses pacientes, o André e o Gustavo conseguiram identificar mutações nesses pacientes. Só que uma porcentagem deles, que aqui são quatro ou cinco, eles não conseguiram identificar nesse panorama de genes que foram sequenciados e aqui que está uma fonte de interesse, porque podem ser que existam outros genes relacionados à biologia dos telômeros que nós desconhecemos ainda e que isso pode... conseguir identificar outros genes que estão envolvidos nessa via de reparo do DNA, especificamente de reparo dos telômeros.

Já nos pacientes com anemia plástica, cada ponto aqui preto é um paciente, você vê que só uma minoria dos pacientes vão estar abaixo do percentil 1. E aqui é um pouco mais difícil a gente identificar mutações. Você vê que de um número razoável de pacientes, eles conseguiram identificar mutações em TINF2 e em TIRT, só em TIRT. três pacientes. Você vê que existe uma diferença, primeiro, do comprimento telomérico, não são todos os pacientes com anemia plástica que têm uma alteração dos telômeros, ao contrário da disceratose congênita, mas mesmo entre aqueles que têm telômeros curtos, o perfil genético é um pouco mais complexo e você vê que ele é um pouco mais reduzido. Aqui mutações em TURT e TURT, enquanto aqui você tem mais genes envolvidos nesse processo.

E dentre essas mutações, então são vários genes que eles colocaram aqui, eu vou chamar a atenção para uma mutação no RTEL1, que é uma mutação nessa região que só está expressa em uma das isoformas, que é a isoforma 3, que é essa região aqui do ring domain dessa helicase, que é o RTEL1, e a Fernanda agora, enquanto ela está no NIH, ela identificou, essa aqui foi a primeira mutação descrita ou identificada nessa região do RTEL1, e ela encontrou numa... Em uma coorte de pacientes lá do NIH, americanos, também uma mutação muito próxima, numa região muito próxima, e ela fez um plasmídio contendo essa mutação para entender melhor o que essa mutação faz com o RTL-1. Então, enquanto no plasmídio selvagem você tem uma colocalização entre esse RTL-1, entre essa helicase e os telômeros em si, aqui representados, pela shelterina TERF2, naquelas células que foram transfectadas com o Arteon mutante, eles não se localizam.

Esse ring domain, ela mostra funcionalmente que essa mutação faz com que essa helicase perca a sua capacidade de se ligar aos telômeros e, portanto, ter a sua função de resolver essas estruturas. Como eu disse, existe um painel muito largo de mutações que acontecem nessas doenças, é bastante heterogêneo e a manifestação clínica é heterogênea. Eu disse, tem anemia plástica, febrose pulmonar, cirrose hepática, também esses pacientes têm um risco muito aumentado para desenvolver leucemia aguda e tumor de cabeça e pescoço.

E é difícil a gente entender o porquê que é tão variada a expressão. o fenótipo dessas doenças. Para tentar identificar isso, a gente havia desenvolvido algumas células pluripotentes, tronco pluripotentes induzidas, a partir de fibroblastos de pacientes com mutação da telomerase.

E eu vou chamar a atenção aqui só para esse par de irmão e irmã. Essa irmã aqui tinha anemia plástica, ela tinha essa mutação que incluía o stop codon. nesse códon 889 e o irmão dela que tinha uma medula hipocelular, mas ele era completamente normal e na verdade isso aqui deve ter, a primeira identificação deve ter mais ou menos uns 8 anos e esse irmão continua completamente bem obrigado. E quando a gente desenvolveu as células IPS desses indivíduos, primeiro aqui são dos indivíduos saudáveis, E essa aqui são os fibroblastos parentais, você vê que à medida que tem passagem tem um encurtamento dos telômeros, mas dos cromossomos você vê que existe um alongamento dos telômeros, porque essas células expressam muita telomerase a partir da reprogramação celular.

Só que dos pacientes com a mutação, você tem um certo alongamento, outros não, mas você vê que é muito deficiente esse alongamento telomérico por conta dessa deficiência. Isso a gente pode ver um pouco melhor nesse gráfico. Aqui são os dois indivíduos saudáveis e aqui são os pacientes com mutação.

Isso é cerca de 50% só de alongamento do que se prevê no indivíduo saudável. Mas o que eu queria chamar a atenção de vocês é esse par de a irmã aqui e aqui o irmão. Embora eles tenham exatamente a mesma mutação, esse indivíduo tem muito mais alongamento do que essa irmã.

que tem um alongamento muito inferior. E isso reflete exatamente o que eles têm clinicamente. Essa irmã aqui tem anemia plástica, depende de transfusão, foi tratada, etc. E ele aqui vai muito bem obrigado, embora tenha uma medula óssea hipocelular.

Então existe alguma correlação aqui, sugerindo que outros fatores, ou genéticos ou epigenéticos, possam estar relacionados a isso. Por outro lado, a Flávia, ela conseguiu desenvolver... Células IPS a partir de fibroblastos de um paciente nosso com mutação no gene DKC1 e o painel aqui, o perfil é totalmente diferente do que a gente tinha visto daquele outro caso da mutação da telomerase.

Nenhum dos clones desenvolvidos, eles conseguem manter o comprimento telomérico. Pelo contrário, você tem uma redução do comprimento telomérico muito grande. Só que existe uma coisa que ela está tentando entender, e a gente não sabe exatamente o que acontece, é que a partir de um determinado momento isso mais ou menos se estabiliza.

E esses clones estão aí na passagem 80, 100, não morreram, não desapareceram, eles mantêm um comprimento telomérico muito longo, eles não melhoram o telômero, mas também não pioram, eles continuam estáveis. Então existe alguma coisa que está acontecendo nessas células aqui, a partir de um determinado ponto, em que eles conseguem manter a sua proliferação, eles não se diferenciam, mas também não tem um alongamento telomérico como a gente preveria. Então esse é um ponto, é uma interrogação e o que ela está tentando identificar é o que pode estar mantendo os telômeros nessas células, sendo que eles não são para ser mantidos.

durante a passagem em células IPS. Mas voltando àquele par de irmão e irmã que eu havia falado anteriormente, quando a gente olha a expressão de TURT e TURC durante a diferenciação, você vê que o irmão tem mais expressão de TURT do que a irmã. Então esse processo se mantém, isso em três clones diferentes, independentes, e se correlaciona com o fenótipo. E quando a gente induziu a diferenciação hematopoética, a mesma coisa acontece. Vamos olhar aqui.

O irmão conseguiu formar muito mais colônias hematopoéticas a partir das IPS do que a irmã. Então, esse é um fato que pode indicar pra gente que existem outros fatores aí que colaboram pro fenótipo e desenvolvimento da doença, ou modulam a penetrância dessa mutação nesses pacientes. Por outro lado, a Florencia, ela ficou interessada em olhar o que acontece naqueles pacientes com anemia plástica que tem telômero normal.

A gente é capaz de fazer células IPS desses pacientes e ela usou uma técnica técnica diferente, em colaboração com a Lígia Pereira daqui do CTC, mas em São Paulo, a partir de eritroblastos. E ela conseguiu formar várias colônias, um número fenomenal de colônias, mesmo em pacientes saudáveis, em relação aos controles. E esses pacientes aqui conseguem alongar os telômeros razoavelmente bem, embora algumas colônias não tenham o mesmo sucesso.

Mas isso pode servir para a gente agora? de plataforma para poder entender os mecanismos de diferenciação hematopoética e os mecanismos imunes que acontecem na anemia plástica adquirida. Mas aqui o nosso interesse maior é justamente nessa heterogeneidade do fenótipo dos pacientes.

E a Raquel, que foi pós-doc, agora está no nosso laboratório, agora está no Albert Einstein. e mais recentemente o João Paulo, que é aluno de doutorado, eles colocaram aqui uma série de pacientes, todos com mutação, a maioria de uma mesma família, mas você vê que uns têm telômero muito curto, outros têm a mesma mutação, mas o telômero é razoavelmente longo e não tem doença, e tentou olhar o que tem de diferente entre esses indivíduos que estão em azul e os indivíduos que estão em vermelho. E uma das coisas que ela quis olhar...

foram nas helicases. Como eu tinha dito, as helicases elas resolvem, são um conjunto de proteínas que resolvem estruturas do DNA. Em especial, tem duas coisas em que o ARTEL1 está envolvido, que é a resolução de G quadruplexes, porque tem muito G na estrutura. TTA-GGG, isso forma estruturas quaternárias no telômero, que precisam ser resolvidas durante a divisão celular. Tanto o RTEL-1 quanto as proteínas de Werner e Blum, que são duas proteínas causadoras de doenças de progérias, doenças progeróides, resolvem essas estruturas.

O João Paulo conseguiu identificar usando um anticorpo. Essas estruturas quaternárias que reconhecem especificamente isso em linhagens celulares. E a Raquel havia observado que tanto a WRN, o Werner, quanto a proteína de Bloom, elas têm uma expressão menor quanto mais curtos os telômeros.

Então pode ser que essas sejam alterações das helicases, sejam outros fatores que contribuam para o fenótipo desses pacientes. E o João Paulo, ele então analisou uma série de helicases e uma série de pacientes e viu que aqueles pacientes que têm os telômeros mais curtos, eles se clasterizam aqui, que têm uma expressão menor de helicases, em relação a indivíduos saudáveis ou alguns pacientes que têm mutação, mas eles não têm o fenótipo da doença. Então, provavelmente, essas helicases estão contribuindo para a manifestação dessa doença.

A Raquel também havia olhado num grupo grande de proteínas relacionadas ao câncer, de acordo com o PCR lá da QIAGEM, mas é uma série de proteínas e ela conseguiu observar que aqueles indivíduos que têm o telômero normal, embora eles tenham a mutação, eles têm um padrão de expressão muito parecido com os indivíduos saudáveis, que são da mesma idade, por exemplo, para ATM, VEGFA. mas que aquelas que tem o telômero curto, você vê que tem uma expressão bastante distinta dos pacientes. Sugerindo então que você tem a ativação ou desligamento de uma série de outros genes que podem influenciar nesse fenótipo.

Como que a gente trata esses pacientes? Então esse aqui é um gráfico de uma paciente enquanto eu ainda estava no NIH, que ela fez por conta própria na década de 90, que ela tinha anemia plástica, que ela tem uma mutação. no sítio da transcriptase reversa e ela foi tratada pelo hematologista dela lá na Pensilvânia com Deca-Durabolin, aqueles que já foram à academia alguma vez já devem ter ouvido falar. E aqui é o gráfico que ela fez do hematócrito dela e que mostra que houve uma resposta muito boa com o uso do Deca-Durabolin. E a gente sabe desde a década de...

Na década de 60, por trabalho do professor Sanchez Medal, na cidade do México, que esteroides anabolizantes têm um efeito positivo em uma porcentagem menor de pacientes com anemia plástica. E o que a gente viu no laboratório agora, quase, sei lá, 40 anos depois, é que os hormônios sexuais, eles estimulam a atividade da telomerase e isso faz com que... Algumas existem regiões responsivas ao estrógeno na região promotora do gene TERT. Então, se tratar essas células com andrógeno ou estrógeno, fazem com que se liguem ao receptor alfa, se não me engano, e aumentem a expressão do gene e aumenta a telomerase.

Baseado nesses achados, ainda quando eu não tinha vindo para Ribeirão Preto, ainda estava indo na EIT, a gente desenhou um estudo que... Acabou sendo publicado agora, recentemente, há alguns meses, que a gente recrutou 27 pacientes com mutações da telomerase, que tinham doença dos telômeros, e o endpoint primário era o comprimento telomérico no sangue periférico. E o que a gente vê, de forma que foi bastante impressionante, é que, primeiro, essa linha aqui é o que a gente esperaria com a idade de encurtamento telomérico para indivíduos saudáveis.

E esse aqui é o encurtamento que a gente esperaria ver nos indivíduos com mutação baseado em dados prévios do que existe de encurtamento nesses indivíduos. Mas o que a gente viu foi o oposto nesses pacientes tratados com o danazol. Então eles foram tratados com o danazol, que nos Estados Unidos não tem o decadobrubolim, que foi abolido, mas você vê que existe um alongamento tempo dependente desses telômeros.

O estudo foi desenhado para dois anos e depois que esses pacientes saíram, Do estudo, você vê que há um encurtamento bastante significativo, eles voltam quase para o que era esperado para eles. Então, tem uma queda muito grande, mostrando que o uso desses hormônios pode promover um alongamento telomérico, pelo menos nesses pacientes. Isso se correlaciona com uma melhora das contagens do sangue periférico e uma estabilidade, pelo menos, da função pulmonar.

Alguns desses pacientes tinham fibrose pulmonar. E a gente conseguiu ver uma estabilidade da função pulmonar desses pacientes durante o tratamento. Aqui no Hemocentro, no Ambulatório de Falências Medulares, a gente tem um estudo bastante semelhante, que é conduzido pelo Diego Clé, que é financiado pelo CNPq, D-City e pelo próprio CTC, usando...

o Decadorabolin, a nandrolona, para o tratamento desses pacientes. Nós temos já, se não me engano, 12 pacientes recrutados, eles não usam uma dose muito grande. O objetivo é recrutar 20 pacientes e dos dados que a gente tem até o momento, ao contrário do uso do danazol, nenhum paciente precisou parar o uso da medicação por conta de toxicidade, isso é importante. E os dados que a gente tem é que houve uma melhora. das contagens do sangue periférico, mas a gente não tem ainda os dados do comprimento telomérico com o uso da nandrolona, tem um ou dois pacientes, mas ainda é muito pouco pra gente poder falar alguma coisa.

Em penúltimo lugar eu queria falar sobre as alterações do fígado e esses pacientes acabam desenvolvendo cirrose hepática, esteatose hepática e a gente não entende muito bem porquê. Então a Raquel ainda quando ela estava aqui no postdoc, ela usou camundongos que são nocaute para telomerase, tanto para enzima em si, quanto para o componente de RNA, que é o TURK, e ela tratou esses camundongos com o experimento Super Size Me, que é o McDonald's, ela dava uma dieta rica em gordura durante 15 dias para esse paciente, praticamente eles iam comer no Burger King todos os dias. E o que ela viu foi que aqueles camundongos que estavam submetidos à dieta hiperlipídica, que só aqueles que eram deficientes da enzima telomerase mostraram alterações muito significativas que a gente pode ver mais claramente nesse slide, que é uma esteatose hepática. Muito intensa. Então aqui você vê que esses blobs brancos aqui é a gordura que se acumula depois de 15 dias, que a gente pode ver nessa coloração aqui e aqui também por body pie que a gente consegue ver uma esteatose intensa depois de 14 dias nesses camundongos, o que não aconteceu nem no wild type, no selvagem, nem no deficiente do turkey.

Tratou esses camundongos com a ZT, que é a zidovodina, que é o inibidor de transcriptase reversa, e ela conseguiu ter exatamente esse mesmo fenótipo nesses camundongos que são deficientes de TURC, mas não nos selvagens. Sugerindo então que é uma atividade da enzima transcriptase reversa, ou uma deficiência dessa enzima que causa esse fenótipo. E ela fez uma análise do metaboloma dessas células e aqui tem um conceito bastante interessante, eu vou gastar um pouquinho mais de tempo nisso, mas ela avaliou todo o metaboloma. Então vamos olhar aqui, esses aqui são os indivíduos selvagens com dieta regular. E eles estão mais ou menos nesse eixo aqui, em PC1 e PC2.

Quando ela tratou esses camundongos selvagens com a doença hiperlipídica, tem um pequeno... deslocamento do perfil metabólico desses animais, um pouco aqui para a esquerda no PC1, mas é mais ou menos isso. Os camundongos Turkey Knockout, eles estão aqui, são muito diferentes para o começo de conversa, o perfil metabólico deles. Só que os animais Turkey, quando eles são tratados com dieta hiperlipídica, eles conseguem responder de uma forma adequada ou semi-adequada à mudança.

da alimentação, a dieta hiperlipídica. Enquanto os camundongos que são deficientes de TURT, quando eles são submetidos à dieta hiperlipídica, praticamente continua a mesma coisa o perfil metabólico deles. Diria que possa existir um termo que eu vou falar aqui que não é exatamente padrão, mas é uma senescência metabólica. Ele é incapaz de responder metabolicamente a uma mudança da dieta. Então, a primeira coisa que a gente quer saber é se isso acontece, isso aqui é em Camundongo, se isso acontece nesses pacientes também.

Então, a Lilia, no laboratório, ela está desenvolvendo, ela desenvolveu algumas células IPS de eritroblasto, de fibroblasto da pele, de pacientes com mutações, aqui é um exemplo de mutações no gene TURC, e ela conseguiu várias colônias com os marcadores todos. E ela agora está desenvolvendo, fazendo a diferenciação hepática desses IPS, para a gente poder ter hepatócitos desses pacientes e poder jogar lipídio ali no hepatócito e saber se a gente consegue reproduzir o mesmo fenótipo que a Raquel havia observado em camundongos. Finalmente, existe uma, como vocês podem imaginar...

Essa manutenção dos telômeros é muito importante para células cancerosas, para neoplasias. A gente já tinha visto que esses pacientes podem desenvolver LMA, mielodisplasia, mas um outro ponto que eu queria falar aqui é que mais recentemente foram identificadas mutações adquiridas na região promotora do gene TURT em pacientes, seja com melanoma, no caso desse do melanoma era uma mutação que ocorreu no organismo. familiar, em caso de uma história familiar de melanoma, e que eles identificaram a mutação constitucional, mas em outros casos são mutações adquiridas, e a célula neoplásica adquire mutações em duas regiões da região promotora do gene TERT, e que isso é a mutação em região não codificante mais comum em tumores e neoplasias atualmente.

E a Raquel havia conseguido, pela primeira vez, ela analisou em células linfóides. E ela olhou em linfomas das células do manto, que é um tipo de linfoma bastante agressivo, que normalmente se leucemiza e o paciente, infelizmente, morre muito rapidamente, porque o tratamento não é efetivo. E ela observou também em outras neoplasias linfóides, que não o manto, mas de células B, principalmente. leucemizadas, para tentar identificar mutações nessa região promotora.

Só que ela identificou apenas essas mutações em indivíduos com linfoma de células do manto, que é mais agressivo, e não teve nenhuma mutação nas outras neoplasias linfóides. Essas mutações estão nessas regiões aqui. por Sanger, especificamente, e ela demonstrou pela primeira vez que essas mutações estão associadas na célula leucêmica a um aumento da expressão de TURT.

Então TURT é mais expresso naqueles que tem mutação do TURT, esses acoloridos aqui são os casos que são homozigotos para mutação, e esse é uma mutação, esse outro, mas em média existe um aumento da expressão da telomere. telomerase em relação àqueles não mutantes e os telômeros tendem a ser um pouco mais longos, mas isso não é tão significativo. Então, e essas mutações adquiridas podem ser um mecanismo adquirido de células neoplásicas que aumentam a sua agressividade e que o tratamento que explore tenha como alvo a inibição dessa via podem ser interessantes nesses pacientes.

E por último, a gente achava antes que os telômeros não sequenciam nada, eles são uma sequência, meio uma borracha na ponta dos nossos cromossomos, que servem para ser desgastada, mas na verdade não é bem assim. A região telomérica também é transcrita, e ela é transcrita nesse RNA, que é um RNA longo não codificante, que é chamado de terra. E ele, então, a sequência de terra, ela começa na região subtelomérica e depois tem regiões, ela tem sequências de UAA, GGG nela, e você tem essas várias sequências que são produzidas na ponta dos cromossomos. Aparentemente, alguns trabalhos mais recentes sugerem que o terra do cromossomo 20Q, talvez seja mais importante na regulação, mas isso a gente precisa entender melhor. alguns têm pontas poliar, e a gente está começando a entender o que a Terra faz.

Aparentemente, eles têm alguma função, tanto de promover o alongamento telomérico, recrutar a telomerase para o sítio, para os telômeros, para facilitar o alongamento, assim como inibir o alongamento telomérico. É uma função, funções paradoxais, e é bastante complexa a sua atuação, mas é um ponto... É muito interessante da fisiologia telomérica e eles podem também atuar distalmente inibindo a expressão de outros genes, que não na região telomérica. E o Leonardo, no laboratório, ele olhou, não existe praticamente nenhuma informação sobre a expressão de terra em células humanas saudáveis, normais ou doentes.

Quase tudo é em camundongo ou em levedura. ou em linhagens celulares. Então a primeira coisa que ele fez foi explorar em sangue e medula óssea de sangue de indivíduos saudáveis.

Existe uma expressão maior de terra, ele olhou três regiões diferentes, 15Q, 10Q e XQ e YQ, mas você vê que existe uma expressão maior na medula óssea em relação ao sangue periférico. Mas nessa abordagem exploratória, uma das coisas muito interessantes que... O Leonardo observou é que terra é altamente expresso em casos de leucemia meloide aguda, o que não acontece, por exemplo, em casos de leucemia linfóide aguda, que praticamente você não tem nenhuma expressão de terra nesses casos, de nenhum desses terras diferentes, de cromossomos diferentes. E agora ele está tentando entender o que é esse padrão, se essa expressão de terra está associada a algum subtipo específico de LMA.

Por que existe essa diferença entre LMA e LLA? E se essa expressão de terra está colaborando para o alongamento telomérico nas leucemias meloides agudas? Se ela é um epifenômeno ou se isso participa ativamente da manutenção ou da malignidade da LMA? Quando a gente olha, é interessante que quando você clasteriza a expressão desses três diferentes terras, mais o comprimento telomérico, os casos de LMA, eu acho que cortou aqui um pouquinho, mas eu acho que esse aqui é o comprimento telomérico. Quando você coloca os três terras mais o comprimento telomérico, você consegue clasterizar especificamente todos os casos de LMA e separá-los, se de outros tumores ou do sangue normal.

Então... Esses são dados bastante recentes, mas tem informação muito interessante de como o reparo e a manutenção dos telômeros podem contribuir para entender na carcinogênese, em especial nas neoplasias hematopoéticas, e como isso pode, de alguma forma, ser alvo terapêutico para o tratamento dessas doenças. Eu já mostrei quase todo mundo, acho que foi faltando...

Se não me engano, duas pessoas, o Gustavo dessa vez eu não esqueci de mencionar, mas ficaram duas pessoas, faltando uma é o Pedro Padilha, que trabalha em uma outra área que não é exatamente telômero, e o Pedro Prata, são os Pedros que trabalham com hemoglobinúria paroxística noturna, então eles não citei. o citei aqui especificamente no trabalho, mas eu queria agradecer também os colaboradores aqui na faculdade, o Badini, que é da pneumologia, e a Ana Martinelli, da hepatologia, alguns colaboradores na Argentina, na Academia Nacional de Medicina, a Irma Slavutsky, nesse trabalho dos linfomas e mielomas também que a gente tem feito, e a minha casa anterior no NIH, no NIH. Em especial ao Niel, que tem recebido vários dos meus alunos lá no NIH. E atualmente, acho que tem uma, só a Fernanda, né?

Fernanda atualmente está lá, mas vários outros já passaram lá. Obrigado, estou aberto a perguntas.

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