istologia lezione 1 in questa lezione analizzeremo le caratteristiche di diversi tipi di microscopia e inoltre i vari metodi di preparazione dei campioni istologici cerchiamo di capire che cos'è l'istologia partiamo dicendo che i viventi sono organizzati secondo diversi livelli il livello fondamentale la cellula tante celle si uniscono a formare un tessuto che un insieme di cellule uguali tessuti anche diversi si organizzano a formare un organo che sono delle strutture in cui tanti tessuti diversi concorrono allo svolgimento della stessa funzione organi diversi ma con una funzione principale comune formano sistemi ed apparati e sistemi ed apparati formano l'organismo bene l'istologia è la parte che studia i tessuti tuttavia le cellule hanno delle piccole dimensioni per cui non è possibile studiarli ad occhio nudo abbiamo bisogno di alcuni strumenti lo strumento per analizzare i tessuti e le cellule e il microscopio qualunque microscopio deve avere determinate caratteristiche la prima caratteristica è il potere di ingrandimento il potere d'ingrandimento corrisponde al massimo ingrandimento che un microscopio permette di ottenere prendiamo ad esempio questo punto con un microscopio con una lente uno per vediamo in un'immagine totalmente uguale se questa immagine le ingrandiamo 20 volte con delle lenti 20 per abbiamo un'immagine 20 volte ingrandita e così via 60 per cento per abbiamo ingrandito l'immagine iniziale di 100 volte in questo modo è possibile studiare al meglio quel punto in iniziale un'altra caratteristica fondamentale di un microscopio il potere di risoluzione significa che se abbiamo due punti separati tra loro da una certa distanza la risoluzione la distanza minima in cui è possibile vedere questi due punti ancora separati cerchiamo di capire meglio prendiamo questi due punti ci mettiamo una lente per ingrandirli usando questa lente i due punti appaiono come un unico punto ingrandito usiamo una lente migliore della precedente vediamo che ci sono due punti che sono quasi separati però in realtà sono ancora uniti nella parte centrale utilizziamo dall'altra lente vedremo che i due punti sono ingranditi però sono comunque separati questo significa che abbiamo usato una lente che alla risoluzione più efficace per questo tipo di tessuto l'occhio umano a una risoluzione massima di 0,2 mm questo significa che all'occhio umano riesce a vedere due punti separati fino alla distanza minima di 0 2 mm se i due fondi si trovano ad una distanza minore il nostro occhio li vedrà come due punti uniti queste erano dunque le caratteristiche essenziali dei microscopi ci sono tuttavia diversi tipi di microscopi il microscopio più sogin istologia e il microscopio ottico toglie microscopio ha una risoluzione di 0,2 micrometri questo significa che è una risoluzione che è 1000 volte migliore dell'occhio umano poi c'è il microscopia contro asso di fase che viene utilizzato per osservare cellule in vivo perché la microscopia ottica uccide le cellule quindi non permette di studiarle mentre sono ancora vive poi ci sono i microscopi attore scienza che sfruttano per l'osservazione le caratteristiche fluorescenti dei corpi e permettono di studiare o dei degli organismi che sono di per sé fluorescenti oppure organismi resi tali dall'utilizzo di fiori cromìe invece microscopia confocale quando si vuole osservare un campione istologico in tutte le sue sezioni in tutti i suoi piani con questo microscopio è possibile farlo poi c'è il microscopio elettronico che è una risoluzione è ancora migliore quindi permette di vedere oggetti ancora più piccoli in maniera più definita la risoluzione di 0,4 nanometri o quella forza atomica con una risoluzione ancora migliore 0,2 nanometri questo è utilizzato per studiare gli atomi poi c'è il microscopia in campo scuro che si utilizza quando non è possibile colorare un campione quindi si renda lo sfondo scuro si rendono sfondo nero in modo da far risaltare il campione in sé in microscopia luce polarizzata si utilizza infine per l'utilizzo per lo studio delle rocce della loro composizione in istologia microscopio ottico quindi cerchiamo di capire come è fatto un microscopio ottico presenta innanzitutto degli oculari gli oculari sono delle strutture formate da delle lenti queste lenti permettono quindi l'osservazione gli oculari provvedono di per se ad un primo ingrandimento questa ingrandimento viene inoltre indicato da un numerino di fianco al foulard e poi è presente l'obiettivo è di solito in un microscopio ottico ce ne sono 3 4 che permettono sempre un ingrandimento maggiore dell'immagine l'obiettivo e gli oculari collaborano insieme ad una ad una complessiva ad un complessivi ingrandimento questo ingrandimento totale viene è possibile calcolarlo moltiplicando il potere di ingrandimento degli oculari per quello dell'obiettivo quindi se gli oculari hanno un potere d'ingrandimento di 20 x dell'obiettivo di dieci per il potere d'ingrandimento totale sarà 20 per 10200 per poi è presente un tavolino portà preparati una struttura che serve per spostare per appoggiare il vetrino su di esso inoltre il tavolino presenta una struttura che si chiama tavolino traslato re per spostare il vetrino sul tavolino porta preparati il condensatore una parte fondamentale del microscopio ottico si trova subito al di sotto del tavolino porta preparati e serve appunto per condensare la luce in modo da osservarla in maniera ottimale questo condensatore è particolarmente importante quando ci sono degli alti ingrandimenti perché deve condensare la luce in maniera perfetta per vedere le immagini ingrandite la luce deriva dalla fonte luminosa che può essere una lampada a led a incandescenza poi è presente un tasto di accensione e le viti macro metrica e micrometrica che permettono l'avvicinamento l'allontanamento del del vetrino in maniera grossolana con l'amaro metrica può sempre più precisa con la micrometrica è presente inoltre un terzo occhio per la telecamera se si vuole proiettare l'immagine che si sta osservando al microscopio per poter osservare un campione e tuttavia assolutamente necessario che il campione venga preparato la preparazione del campione avviene in diversi stati la prima fase la fissazione poi c'è la disidratazione la diafani d'azione l'inclusione il sezionamento è la colorazione partiamo con la fase di fissazione la fissazione è una fase che nasce per risolvere un problema preciso se otteniamo un tessuto se prendiamo un tessuto e lo lasciamo esposto all'ambiente esterno questo tessuto si degraderà quindi perderà tutte le caratteristiche fisiche e chimiche che aveva nel momento in cui è stato prelevato la fissazione a serve a evitare proprio che si perdano questa queste caratteristiche che sono quelle che un osservatore vuole osservare la fissazione quindi consiste nel conservare tutte le componenti del tessuto la fissazione può essere di due tipi chimica e fisica la fissazione chimica utilizza dei fissativi chimici che sono delle sostanze che vengono scelte a seconda del risultato che si vuole ottenere si immerge il tessuto o in una soluzione di alcol etilico quando si vuole che il tessuto perde lipidi o in delle aldeidi come la formaldeide o la para formaldeide quando si vuole che il tessuto con servili pd diversa è la fissazione fisica la fissazione fisica è una fase che consiste nel congelamento del campione il campione viene inserito in una dell'azoto liquido che ha una temperatura di meno a 170 gradi quindi viene congelato i campioni che vengono trattati con la fissazione chimica non devono subire il processo di disidratazione di inclusione i campioni trattati con la fissazione chimica passano alla disidratazione e alla di afa nizzazione la disidratazione consiste nell'eliminazione di acqua l'acqua viene eliminata perché un un campione che possiede l'acqua una consistenza molle i campioni dovranno poi essere tagliati in diverse sezioni ovviamente il sezionamento avviene in maniera ottimale quando il campione presenta meno acqua possibile la disidratazione viene effettuata immergendo il campione in delle soluzioni di alcol etilico con con concentrazioni di alcol sempre maggiori 50 70 90 95 fino a 100 per cento in seguito alla disidratazione cela diafani zazione la di afganizzazione serve a rendere il campione trasparente della si ottiene immergendolo in dello csea lo lo csea loro è una sostanza che oltre a rendere trasparente il campione anche delle altre proprietà infatti lo csea loro innanzitutto solo bidelli pd inoltre scioglie l'etanolo in questo modo si rende trasparente il campione la fase successiva e l'inclusione l'inclusione è una fase che nasce da un da un altro problema bisogna immergere il campione in una sola stanza che abbia una consistenza tale da permettere al campione di essere tagliato quindi deve essere una sostanza che è liquida alle alte temperature e solida alle basse temperature le sostanze che vengono utilizzate per l'inclusione sono la paraffina fusa e la resina epossidica che appunto sono delle resine che hanno queste particolari caratteristiche di comportarsi diversamente a diverse temperature si ottiene quindi dall'inversione del campione si ottiene un blocco che verrà poi sezionato si utilizza di solito la paraffina per la microscopia ottica perché non c'è bisogno di avere una consistenza così dura quindi la paraffina una consistenza più molle la resina epossidica invece si utilizza per la microscopia elettronica visto che si devono fare delle sezioni ancora più sottili c'è bisogno che è il campione abbia una determinata consistenza questo è l'aspetto di un blocco di paraffina con una parte più scura al centro che la parte che corrisponde al al tessuto al campione si procede poi con il sezionamento il sezionamento consiste nel taglio del preparato istologico in diverse sezioni che devono avere lo stesso spessore queste sezioni e il loro taglio devono avere lo spessore di 3 10 micron che è uno spessore tale da permettere alla luce di oltrepassare il di oltrepassare la sezione in modo da poter essere osservato al microscopio ottico il taglio viene effettuato con un microfono in un meccanismo automatico il sezionamento risulta diverso per i campioni trattati con la fissazione chimica innanzitutto perché questi campioni non subiscono disidratazione di afganizzazione inclusione questo avviene per il fatto che non c'è bisogno di merger i campioni in una sostanza che dia la consistenza giusta per poterli tagliare perché il congelamento ottenuto con la fissazione già abbastanza per rendere il campione selezionabile le sezioni vengono fatte con un primo microfono che taglia in diverse sezioni mantenendo una temperatura bassa in seguito tali campioni vengono portati a temperatura ambiente e si procede poi con con la colorazione torniamo ai campioni trattati con la fissazione chimica dopo aver fatto il sezionamento i campioni vengono vengono appoggiati su un vetrino porta oggetti su cui era stata messa una sostanza adesiva e si lasciano poi alla fuga il vetrino viene poi nuovamente immerso nello xilo box in questo caso viene utilizzato per poter rimuovere la paraffina perché non c'è più bisogno di ottenere quella consistenza quella consistenza più dura che si è tenuta con l'inclusione successivamente si procede con unar e idratazione che si ottiene immergendo il vetrino in soluzioni con delle concentrazioni via via decrescenti di alcol etilico 100 95 90 e 70 per cento perché il campione viene reidratato viene reidratato per preparare il campione alla successiva fase di colorazione infatti i coloranti che avevano utilizzati sono dei coloranti idrofili quindi si favorisce il legame tra il colorante il campione re idratando il tessuto la fase successiva e la fase di colorazione