Técnicas de Inmunofluorescencia e Inmunohistoquímica

Principios Generales

• Ambas técnicas se basan en la unión específica entre un anticuerpo y su antígeno específico.
• Utilizadas en laboratorios de biología celular y análisis clínicos.

Inmunofluorescencia

• Se basa en la unión específica entre un anticuerpo y su antígeno.
• Los anticuerpos están conjugados con sondas fluorescentes para visualizar moléculas blanco en células, fluidos o tejidos.
• Microscopía de fluorescencia: Es utilizada para visualizar la emisión de luz de los fluoróforos.

Proceso

1. Célula expresa un antígeno específico.
2. Anticuerpo específico es conjugado a un fluoróforo (p.e. verde).
3. La emisión de luz del fluoróforo permite visualizar la presencia del antígeno.

Tipos de Fluoróforos

• Citosina
• Fluoresceína (FITC)
• R-phycoerythrin (R-PE)
• Cada uno emite a diferentes longitudes de onda, permitiendo visualizar colores como naranja, verde y rojo.

Multiplexación

• Uso de diferentes anticuerpos conjugados a diferentes fluoróforos en una misma muestra permite identificar múltiples antígenos y observar su localización.
• Ejemplo: Colocalización de marcajes rojo y verde resulta en color amarillo.

Inmunofluorescencia Directa

• Anticuerpo contra el antígeno de interés se encuentra directamente conjugado a un fluoróforo.

Inmunofluorescencia Indirecta

• Uso más común en laboratorios.
• Se usa un anticuerpo primario para reconocer al antígeno de interés y un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo que reconoce inmunoglobulinas del anticuerpo primario.
• Permite amplificar la señal, ya que varios anticuerpos secundarios se pueden unir a un primario.

Ejemplos

1. Lengua: Uso de anticuerpos con marcajes rojo y verde para observar células medulares y el factor de transcripción Aire.
2. Centro Germinal: Diferenciación de linfocitos B proliferantes (verde) y células dendríticas foliculares (rojo), con células CD4+ (azul).

Inmunohistoquímica

• Similar principio de unión entre anticuerpo y antígeno.
• En lugar de fluoróforos, se utilizan enzimas conjugadas a los anticuerpos.
• Enzimas comunes: Peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina.

Proceso

• Enzimas catalizan la transformación de un sustrato incoloro en un producto coloreado.
• La precipitación del producto coloreado en la región del anticuerpo se observa mediante microscopía óptica.

Pasos

1. Fijación de células o tejidos.
2. Uso de anticuerpo primario específico para el antígeno de interés.
3. Anticuerpo secundario anti-inmunoglobulinas conjugado a una enzima.
4. Enzima cataliza transformación de sustrato en producto coloreado.

Ejemplo

• Cáncer de Pulmón: Detección del antígeno PD-L1 para predecir la efectividad de tratamientos de inmunoterapia.
• Diferentes intensidades de marcado indican niveles de expresión del antígeno PD-L1.