Overview
La clase trata sobre la secuenciación de ADN, especialmente la técnica Sanger, su fundamento, aplicaciones y el análisis de resultados, diferenciando con otras metodologías de secuenciación.
Introducción a la secuenciación de ADN
- La secuenciación determina el orden exacto de los nucleótidos (A, T, C, G) en un fragmento de ADN.
- Se utiliza para comparar una secuencia analizada con una referencia y detectar variaciones.
- Es fundamental para estudios genéticos, diagnóstico y análisis de mutaciones.
Evolución de las técnicas genéticas
- El microscopio de luz permitía ver cromosomas grandes y detectar aneuploidías.
- El cariotipo de bandeo G mejoró la resolución, permitiendo ver grandes alteraciones cromosómicas.
- La técnica array CGH permite ver regiones de 50-100 kilobases.
- Sanger trajo resolución a nivel de un solo par de bases, detectando cambios puntuales.
Tipos de secuenciación y aplicaciones
- Sanger permite analizar hasta 1000 pares de bases, útil para mutaciones puntuales o genes conocidos.
- Paneles de genes se usan cuando el fenotipo es específico y hay genes conocidos relacionados.
- El exoma analiza solo regiones codificantes, útil en fenotipos complejos.
- El genoma cubre toda la información genética, incluyendo intrones y regiones reguladoras.
- Técnicas como FISH, MLPA y array CGH se usan para grandes pérdidas o ganancias genéticas.
Principios y pasos de la secuenciación Sanger
- El proceso inicia con la extracción de ADN y una PCR convencional para amplificar la región de interés.
- La reacción de secuenciación usa nucleótidos normales y dideoxinucleótidos marcados con fluorocromos.
- La incorporación aleatoria de dideoxinucleótidos genera fragmentos de diferentes longitudes.
- Los fragmentos se separan por electroforesis capilar y se detectan por fluorescencia.
- El electroferograma muestra el resultado en colores según el fluorocromo de cada base.
Análisis e interpretación de resultados
- El análisis se realiza mediante software, que presenta el electroferograma y la calidad de cada base.
- La calidad de la secuencia se mide con el Phred score; un valor mayor a 30 indica alta confianza.
- Problemas comunes: ausencia de señal, baja calidad, múltiples picos por primers inespecíficos o errores en la PCR.
- Es vital verificar siempre el electroferograma, no solo confiar en el software.
- Errores en la preparación o en la especificidad de los primers pueden generar lecturas solapadas.
Aplicaciones y limitaciones de Sanger
- Sanger se usa para confirmación de variantes puntuales, estudios de portadores y análisis de genes específicos.
- Aplicaciones: genética humana, microbiología, farmacogenética.
- Limitación principal: solo sirve para fragmentos pequeños (hasta 1000 pb).
Key Terms & Definitions
- Secuenciación Sanger — Técnica para determinar el orden de nucleótidos en un fragmento de ADN.
- Dideoxinucleótidos (ddNTPs) — Nucleótidos terminadores marcados con fluorocromos que detienen la síntesis de ADN.
- Electroforesis capilar — Método para separar fragmentos de ADN por tamaño usando un polímero en capilares finos.
- Electroferograma — Gráfico resultante que muestra la secuencia de nucleótidos detectada por fluorescencia.
- Phred score — Escala logarítmica que mide la calidad de la llamada de base en una secuencia.
- SNP (Polimorfismo de un solo nucleótido) — Cambio puntual de una base en la secuencia de ADN.
Action Items / Next Steps
- Ver los dos vídeos sobre secuenciación Sanger en la plataforma.
- Preparar el quiz relacionado con secuenciación en sangre.
- Practicar interpretación de electroferogramas y evaluación de calidad.
- Repasar conceptos de PCR y diseño de primers.