Secuenciación de ADN y técnica Sanger

Sí, en lo que nos va a determinar cuáles son los nucleotíos que están en un fragmento de ADN. Nosotros tenemos nuestro ADN, lo extraemos, recuerde que siempre hacemos un proceso de extracción que usted ya hizo en el laboratorio, pero nosotros no somos... vemos allí cuál es el orden de esos nucleótidos. El señor te puede decir, mira, aquí hay una, una, ni siquiera se ve, ¿cierto? O sea, es muy pequeñito y no podemos visualizar eso. La secuencia de los ángeles nos va a ayudar a determinar el orden de estos nucleótidos. ¿Con cuál objetivo? Pues con el objetivo de ver cuáles son las variaciones entre una secuencia de referencia y entre la secuencia que nosotros estemos analizando. ¿Listo? Entonces, vamos a iniciar y vamos a abrir la clase en varios momentos. ¿Listo? Vamos a empezar la clase y vamos a terminar hasta donde veamos secuencias en sangre. Allí vamos a hacer el quiz, o sea, de retiración flexible, hacemos el quiz, que sí es necesario realizarlo, y después de realizar el quiz vamos a descargar. computadores, otros no, igual vamos a hacer el proceso y vamos a crear unos grupos y les voy a mostrar cómo se utilizan unas bases de datos y cuáles bases de datos sí se pueden utilizar en las tablas de unos celulares para que ustedes sepan cómo es el proceso. ¿Por qué? Porque la idea, más que el proceso de IPT es que ustedes entiendan cómo analizar los resultados. Obviamente van a tener que conocer cuál es el proceso y para qué sirve cada técnica porque ustedes son los que en su debido momento van a evaluar o van a enviar la técnica. O sea que tienen que saber para qué sirve cada técnica, cuál es la técnica que van a utilizar y cuál es el resultado esperado o con qué objetivos van a enviar eso. ¿Listo? Es súper importante que estén atentos a esta clase porque esta es como la base para que ustedes entiendan la siguiente clase, las siguientes dos clases que son secuenciación de nueva generación, Illumina y Nanopore. Si se pierden en esta, vamos por favor diciéndome en qué paso a paso se van perdiendo, porque si no el jueves van a estar. super embolatados, ¿listo? Entonces vamos a empezar Entonces, ¿qué es la secuenciación, chicos? La secuenciación consiste en la determinación del orden que tienen los nucleótidos en un fragmento de ADN Entonces tenemos aquí de nuevo la célula es una célula eucariota recordemos que el ADN está en el núcleo de la célula puede ser enrollado en su forma más condensada como es cromosoma, y cuando nosotros pues digamos que enrollamos ese cromosoma, tenemos una doble hélice de DNA, ¿sí? Esta doble hélice de DNA está conformada por nucleótidos. Y estos nucleótidos pueden ser adenina, timina, citosina o guanina. Lo que nosotros queremos ver con la secuenciación es cuál es el orden. O sea, si hay una guanina primero, si hay una adenina en el segundo, si hay una timina, si hay una citosina. Nosotros vamos a ver hoy secuenciación Sanger, que es uno de los tipos de secuenciación. Existen diferentes metodologías para nosotros poder ver cuál es el orden de estos nucleótidos. Y básicamente lo que nosotros queremos obtener es esto. Que me diga que primero hay una G, que luego hay una T, que luego hay una A, ¿sí? Esto es lo que nosotros queremos lograr al final, que nos dé el orden de esto. ¿Con qué objetivo? Pues con el objetivo de que nosotros luego lo alineemos con una referencia, como al armando un rompecabezas, y no sé si han visto estas imágenes que dicen en contra de las siete diferencias, ¿sí? Entonces, háganle cuenta de eso. Nosotros tenemos una región de ADN que viene así en nucleótidos, en K, A, C, D, T, y nosotros encontramos la diferencia. contra una referencia ya lo vamos a hacer el proceso y ya vamos a ver cómo se actualiza entonces entrando un poquito de historia las técnicas de genética de biología molecular han ido avanzando a lo largo de la historia entonces así como mario bros en el principio tenía una baja resolución y luego los detalles son más específicos y uno podía ver mucho mejor como la calidad de la imagen, básicamente lo mismo pasó con estas técnicas. de biología molecular o de genética. Cuando nosotros iniciamos, la primera técnica en la parte de genética o de biología molecular fue el microscopio de luz. En el microscopio de luz lo que nos permitía ver eran los cromosomas gigantes, o sea que solamente nos permitía diferenciar entre anectoidías o polifloidías. O sea, por decir, digamos, así tenemos un cromosoma extra, tenemos un cromosoma menos, eso es lo que a nosotros nos permitía visualizar. Pero nosotros no podíamos podíamos ver si un núcleo te ha cambiado, porque veíamos ese cromosoma completo. Luego seguimos con algo que se llamaba un cariótipo de bandeo G, lo cual nos permitía como marcar unas diferentes regiones dentro del cromosoma. Y esto sí nos permitía comparar pero regiones muy grandes, o sea, nosotros podríamos visualizar, digamos que ni se partía toda una colita, si había una lesión muy grande, o si se traslocaba, o sea, Gracias. ver algunas pequeñas cosas por las diferentes bandas que se marcaba pero igual seguía haciendo algo que podíamos visualizar por mí un microscopio sea algo mucho más grande visto la resolución cuando hablamos de resolución es como ¿Qué tan específico nos permite ver una imagen? No sé si ustedes de pronto vieron en los celulares antiguos que sea un megapíxel, que uno vea como la imagen distorsiona, o los videos antiguos de películas, de lo que sea, que la imagen es como borrosa, como que... que uno no logra ver bien el detalle. En cambio, ahorita, entre mejor sea la cámara, uno le ve el porito, o sea, entonces a eso hablamos de resolución, como que qué tanto podemos ver a detalle, es, digamos, el material genético en este caso, que es lo que estamos evaluando, ¿sí? ¿Es claro eso, el concepto de resolución, chicos? Perfecto. Entonces, por lo menos en el carácter tipo bandeo G nos permitía visualizar modificaciones desde 5 a 10 megabases. Cuando hablamos de megabases, una megabase es un millón de pares de bases. O sea que si había una pérdida de 2 millones de pares de bases, la podíamos ver. ¿Sí? Porque, perdón, de 10 millones de bases la podíamos ver. Pero por lo menos, si había una pérdida de 100 mil pares de bases, pares de bases no se iba a ver porque no alcanzábamos a ver el detalle, ¿listo? Luego hay otra técnica que van a visualizar en genética que es la raíz de GH, que es comparativo y que nos ayuda a determinar también regiones grandes, en este caso son como unas sondas enormes y nos va a poder permitir diferenciar de 50 a 100 kilobases, cuando la base de una kilobase son mil bases, o sea que básicamente sería nos permitir diferenciar de 50 mil a 100.000 pares de bases. ¿Es claro, chicos? Hasta allí. Y esto usualmente es utilizado para algo que se llama análisis de CNV. Cuando llegó la secuenciación Sanger, que con eso fue cuando se hizo todo lo del genoma humano, no sé si escucharon, que ese proyecto duró un mundo de tiempo, como 23 años, que hace poco apenas terminamos de tener como la secuencia de referencia completa, completo así cuando se... esto descubrió la secreción Sanger, nosotros podemos tener la resolución de un par de bases. ¿Qué significaba esto? Nosotros un par de bases no lo podemos ver a microscopio, claramente, ¿sí? Este par de bases nosotros lo vamos a evidenciar en esto, en modificaciones de un nucleótido, o sea, nos va a permitir visualizar si hay un cambio de un solo nucleótido, o sea, si cambia una guanina por una citosina, si cambia una actimina por una anemina, si nos permite ver esa modificación. Por eso la resolución es de un par de bases, ¿ya? Esta es la técnica que nosotros vamos a ver hoy. ¿Cuál es el inconveniente, o digamos que cuál era la alimentación de la secuenciación Sanyo? Que nos permite analizar pequeñas, ¿ya? O sea, cuando se hizo por primera vez el genoma, hagan de cuenta que era... Un rompecabezas gigante con piecitas chiquiticas. Entonces, armar eso fue muy difícil porque cada piecita era muy chiquitica, ¿listo? Entonces, por eso nos demoramos como 20 años. Cada fragmento de la secuenciación Sanger nos permite visualizar a máximo, máximo, mil pares de bases. Esto es un dato importante y anótenlo o ténganlo presente porque eso nos ayuda como a determinar cuándo escoger una técnica o cuándo escoger otra, ¿listo? Como en la secuenciación Sanger nos permite solamente visualizar pequeños fragmentos, o sea, al máximo mil pares de bases, ¿sí? Se crearon otras técnicas, ¿ya? ¿Cómo son las técnicas de nueva generación? Y entonces allí ya vienen conceptos de panel, de exome y de genoma, que vamos a ver mejor en las próximas clases. Y básicamente la diferencia entre panel, exome y genoma, más que el panel, no es específico para ágenes. como para un grupo de genes específicos relacionados con una patología puntual, los exomas están relacionados simplemente con regiones codificantes, exoma viene del exón, y acuérdense que los exones son las regiones que codifican. Mientras que el genoma es lo que ahorita se hace con mayores fines de investigación, incluye todo, incluye los intrones, incluye los exones, porque acuérdense que cuando veíamos el dogma central de la hidroquía molecular, decíamos que había un par de... martes que estaban alejados que eran promotores, que si había modificaciones en los intrones pues podían afectar por el esplaxi, entonces por eso es digamos que mucho más difícil el análisis porque hay más información, nos está dando todo, exones, intrones, promotores, todas las regiones, pero pues digamos aunque es más difícil el análisis tenemos una mayor cobertura. el panorama real, ¿listo? Igual, tranquilos chicos, que esto lo vamos a ir visualizando poquito a poquito, esto es como un panorama general para que vean cuáles son las diferentes técnicas que hay. Entonces resulta que pues como ya vieron, hay un amplio tipo de pruebas diagnósticas genéticas. Entonces ustedes dirán, bueno profe, ¿y nosotros cómo sabemos cuáles son las pruebas a enviar y en qué momento enviarlo? genética, pues ya le han ido orientando en algunas cosas de cuáles son las pruebas para usarlo, pero aquí queremos que más que se lo aprendan de memoria, es que aprendan el por qué utilizo una, por qué utilizo la otra, o si en algún caso puedo cambiar de prueba sin ninguna consecuencia. secuencia, ¿listo? Entonces, tenemos diferentes tipos de mutaciones. ¿Cuándo hablamos de una mutación? Nosotros hablamos de una mutación cuando hay una variación en nuestra secuencia de referencia. ¿Es claro eso hasta allí? ¿Es claro lo que es una mutación, chicos? Entonces, pueden haber mutaciones que se conocen como SNPs o pueden haber mutaciones que no son SNPs. Cuando hablamos de SNPs, son variantes o polimorfismos de un solo nucleótido. O sea que el cambio va a ser de un solo nucleótido o de poquitos, o sea, chiquititos. Y tenemos unas perdidas y renancias de materiales genéticos, o sea que son regiones enormes de lo que hablábamos, de una megabase, de cien kilobases, que son mucho más grandes, ¿listo? Esos son como los dos tipos grandes de... Lo primero que nosotros vamos a pensar. Cuando estamos hablando de seis o variantes, puede ser que tengamos una mutación puntual o bien conocida. Entonces yo les digo un ejemplo. Si estamos hablando de un paciente. que ya tiene un diagnóstico genético, ¿sí? Que ya sabemos que tiene algo y que tiene una variante puntual, ¿listo? Y vemos que tiene un hermanito y el hermanito nace exactamente con el mismo fenotipo, entonces nosotros lo primero que vamos a hacer, pues no vamos a pensar en un síndrome nuevo, ¿no? Lo primero que vamos a hacer es confirmarle si realmente tiene lo mismo el hermano, ¿listo? Entonces en ese caso, como es una mutación puntual, pues ya hacemos específicamente para esa mutación puntual. Otro caso, por lo menos cuando estamos hablando de enfermedades autosómicas recesivas, ¿sí? El estudio de portadores. ¿Saben qué es un portador? ¿Saben qué es autosómico recesivo? ¿Saben qué portador? Siempre me lo expreso. Exacto. Entonces, acuérdense que cuando hablamos de autosómico recesivo es una enfermedad que necesita que los dos alelos estén afectados para que sucese la enfermedad. ¿Sí? ¿Hasta ahí estamos todos claros? Listo. Entonces, como dijo Juan José como dijo Juan José entonces en este tipo de enfermedades es muy importante hacer estudios de portadores para uno determinar cuál es el porcentaje digamos de probabilidad que tiene de tener a tu hijo afectado de saber si el hermano digamos del paciente tiene probabilidad de tener un hijo afectado o en estudios digamos de consejería genética saber si ambos tienen la probabilidad o no de tener hijos afectados como dijo Juan José, un portador es aquel que tienes solo una copia afectada, o sea, tiene el gen, lo puede transmitir, pero no está expresando la enfermedad porque el otro alelo está bien. ¿Es claro eso hasta allí, chicos? ¿Sí? Listo. Hay genes, digamos, que son relacionados con fenotipo, entonces se hacen paneles de genes, entonces por lo menos, un ejemplo, ¿qué tiene una cardiopatía? Entonces cuando nosotros hacemos un panel de genes y cogemos todos los genes que se han relacionado con Gracias. y lo evaluamos, solamente esos genes, ¿ya? Eso nos ayuda como a ampliar el panorama, pero a tenerlo como solamente enfocado en ese fenotipo, si el fenotipo es muy específico. ¿Listo? O tenemos desconocimiento de genes relacionados con el fenotipo. Entonces resulta que hay algunos casos donde el fenotipo es demasiado polisindrómico, o sea, tenemos demasiadas cosas. Tenemos afectación cardíaca, afectación en los ojos, afectación en la piel, afectación en múltiples lugares, entonces pues no podemos hacer como un panel, porque incluiría a todos los genes. En esos casos específicamente es cuando se recomienda hacer un exoma. ¿Listo? ¿Por qué? porque vamos a incluir todas las reglas. regiones exómeras codificadas. Si ya vemos que el exoma definitivamente no nos funciona, pues haríamos un genoma que va a arcar mayor cantidad de genes. ¿Listo? Por otra parte, cuando estamos hablando de pérdidas o ganancias de material genético, podemos hacer regiones clomosomas específicas, como es el FISH o el MLPA, que son técnicas que van a revisar ustedes específicamente en genética, o podemos hacer un gen... o evaluar el genoma completo mediante raíces GH, que también es una técnica más genética que también van a visualizar en la asignatura de genética. Entonces chicos, solo para rebobinar, cuando nosotros estemos hablando de mutaciones puntuales, estudios de portadores, cuando vayamos a confirmar una variante, cuando sea algo muy específico vamos a utilizar secuenciación Sanger, ¿sí? Porque secuenciación Sanger solamente nos va a permitir ver el orden de los nucleótidos máximo de cuántas? De mil pares de bases. Y acuérdense que el genoma tiene tres billones de pares de bases. o sea que si nos ponemos a secuenciar todo con con Sanger, pues nos demoramos 20 años como se demora el proyecto genoma humano y pues eso no sería beneficioso para nosotros, ¿sí? Pero si nosotros queremos ver algo específico, una región puntualcita, por lo menos una nene de cerdas falsiformes, que es dada por una mutación específica, entonces sabemos que allí sí evaluamos secuenciación Sanger, porque solamente si hay 2.000 pares de bases, si vemos y en esos 1.000 pares de bases está la mutación de nuestro interés. Entonces, secuenciación Sanger, mutación puntual, gen conocido, estudio del portador. ¿Listo chicos? Entonces, existen diferentes tipos de secuenciación. La secuenciación ha ido avanzando. La primera que les comenté fue de la secuenciación Sanger, o de las que vamos a hablar hoy, pero también hay unas secuenciaciones que son de segunda generación. o de tercera generación. ¿Listo? La de hoy es secuenciación Sanger de primera generación. Esto es importante que lo tengan en cuenta. La secuenciación de segunda generación es Illumina, que la van a ver el jueves. La tercera generación incluye Nanopore, que es la que vamos a ver el otro martes. ¿Listo chicos? Entonces vamos a ver cada una, pues la más importante, la más relevante en la historia de la secuenciación, la que más se utiliza. ¿Listo? Obviamente hay diferentes plataformas, pero por lo menos en el caso actualmente las que más se utilizan son para diagnóstico médico, son secuencias en Sanger y Lumina que está super abatada en el ámbito médico y actualmente Orformano porque también está pues bastante... en BOO, por decirlo así. Cuando nosotros hacemos la secuenciación dependiendo de la tecnología que hagamos de acuerdo del enfoque, entonces tenemos que recordar que Sanger está indicado para una región específica. Yo sé que me vuelvo canciona, pero es importante que diferencien. ¿Listo? Porque eso les va a servir cuando estén haciendo el proyecto final de ustedes. Saben que si de pronto quieren ver todo el genoma completo de una planta, no sé, medicinal, pues no van a utilizar secuencias de Sanger porque se van a enamorar un montón. ¿Listo? ¿Listo? O sea, de una vez les digo, metodología errada, o sea, en ninguna parte te van a aceptar esto, ¿listo? Pero si tú me dices, no, lo que pasa es que quiero ver de esa planta solamente porque esta cepa tiene, no sé, el beneficio farmacológico y esta cepa no, ¿ya? Y ya sabemos que está en esta región específica, entonces pues ahí sí pueden utilizar secuencias de ensayo, ¿sí? O sea, todo depende de cuál sea el objetivo que ustedes quieran abordar, ¿listo? Entonces, varía. Variantes detectadas solamente en regiones codificantes o puede ser en regiones no codificantes. Variantes por persona. Como es tan pequeña la región del mil pares de bases máximo que vamos a tener, probablemente uno encuentra entre 0, a veces en algunas regiones, pero el promedio es entre 3 a 30 variantes. ¿Listo? En la región analizada por persona, ¿sí? Porque acuérdense que nosotros tenemos algunos variantes que son patogénicas y otras variantes. que no son patogénicas y que es lo que nos permite ser diferentes entre cada uno de nosotros. ¿Quieres hacer una pregunta? ¿Cómo ha sido el día antes? Ok, recuerda que nosotros aquí estamos viendo el orden de los nutrientes, ¿sí? Entonces, esperen. Chicos, si tienen preguntas, díganme, que la idea es que aprendan bien, porque ustedes van a hacer un taller sin traplicación y entonces, digamos que ya no los puedo llevar, ¿listo? Entonces chicos, digamos que nosotros tenemos, hay una... de datos que ya existen que son estos de referencia nadie se lo sabe y nadie se lo aprende porque son tres millones de combinaciones innecesario, por eso están los vasos de diálogo. Entonces este ejemplo me lo voy a invitar, ¿listo? Entonces digamos que estamos evaluando el gen HBB que es de la hemoglobina, ¿listo? ¿Sí? Entonces resulta que en mi base de datos de referencia dice que para este gen Obviamente el gen es más grande, pero vamos a decir que este es mi gen, esta es la referencia, esta es la que está bien, ¿sí? La ideal, la que todos deberíamos, o la que mala mayoría... de personas debería tener, ¿listo? Esa es la que está en la mayoría de la población. Porque esa base de datos se hizo como homogeneizando muchos datos, miles de datos de genomas de personas, ¿listo? Entonces, voy a evaluar un paciente ¿Sí? Y resulta que este paciente tiene una A, una T, una C, una G, y aquí tiene una G, una A, una T y una G. Mire que esto está igual, esto está igual, esto está igual, estos están iguales a los de referencia, ¿sí? Pero en este caso, ¿qué pasó? Hay una mutación, hay una variante. ¿Por qué? Porque mire que debía haber una T y hay una G. O sea que eso es una variante. Esto es una variante. Esta está bien, esta está bien, esta está bien, ¿sí? Entonces mire que el resto de datos está bien. Entonces diríamos que en esta secuencia ¿cuántas variantes hay? Una sola variante, ¿cierto? que es la G, una variante. Recuerden que en secuenciación Sanger este fragmento es de mil pares de bases máximas, ¿sí? Puede ser 400, 500, 600, de acuerdo a cómo uno lo haga, ¿listo? Entonces, por eso es que digo que... uno puede encontrar de 3 a 30 variantes por persona. O sea que en mi fragmento de, o sea, este fragmento de mi par de bases, probablemente voy a encontrar 3 que no coincidan con mi referencia, o 5, o 6, o 7. ¿Sí es claro que es una variante? ¿Aquí qué es importante, chicos? Aquí es algo importante que no todas las variantes, como ya se los mencioné, son patogénicas, no todas las variantes son malas, ¿ya? Y vamos a aprender a evaluar cuando una variante es buena Gracias. y cuando una vez es mala, ¿listo? Ahorita las hacemos un ejercicio, ¿sí? Entonces, digamos que una cosa es detectarlas y otra cosa es analizarlas y clasificarlas, ¿listo? ¿Hasta allí es todo claro? ¿Sí? ¿Todos? ¿No? Sí. Bueno, chicas. Entonces. Todo eso hacía parte de las generalidades. Yo sé que de pronto hay unas cosas que quedan como imprecisas. Vamos a ver secuenciación sangre, la otra clase vamos a ver ilumina y volvemos a tomar las generalidades como para que queden súper claros esos conceptos. ¿Listo? Para hacer secuenciación Sanger vamos a tener un flujo de trabajo, ¿listo? Cuando digo flujo de trabajo es cuál es el paso a paso hasta yo obtener una secuencia Sanger, ¿listo? Lo primero que tenemos que hacer es que el chico... la extracción de ADN o de ARN, dependiendo de lo que queramos hacer. Recuerden que si es ARN tenemos que hacer una transcriptaza reversa para pasarlo a CDNA. ¿Listo? Pero siempre vamos a partir de... de ADN. Entonces lo primero que tenemos que hacer es la extracción. ¿Listo? Luego tenemos que hacer una PCR convencional. ¿Cuál? La primera que vimos, la que hace por electroforesis, la que uno... visualiza en el ejercicio de agarosa, ¿sí? Eso es porque nosotros primero tenemos que delimitar cuál es la región de nuestro interés. ¿Recuerdan que cuánto es el máximo tamaño de fragmentos de Sanger? Mil. Entonces nosotros vamos a hacer, tenemos nuestra biblioteca completa que es todo nuestro material general, ¿cierto? ¿Sí? Entonces cogemos y le sacamos muchas copias a la página 10 que es la de nuestro interés, ¿sí? Y después de sacarle muchas copias de la página y es que nuestra página de interés sí allí si empezamos a ver letra por letra que lo que dice nuestra página 10 entonces acuérdense como ese grupo los primeros traemos el adn luego hacemos una pc recombinación al que sacarle muchas copias al reguento de interés y luego así hacemos la secuenciación sanger que es ver cuál es el orden de esos nucleótidos de esta amplificación de la pc y finalmente hacemos el análisis o la detección Entonces chicos, importante recordar que siempre la secuenciación Sanger tiene una PCR incluida. Por eso cuando digamos PCR convencional, imagino que Lore les dijo que la PCR puede ser la prueba final o puede ser una prueba intermediaria. Y van a ver en Illumina que se utiliza otro tipo de PCR. En este caso para Sanger es PCR convencional. ¿Listo? Entonces, vamos a ver un videíto primero y ya les explico para que ustedes... Y ya vamos a la teoría, ¿listo? Entonces, aquí lo que vamos a visualizar es como tal, qué es lo que hacen hace unos años. Yo les subí varios videítos, dos videítos, es bueno que los revisen para que les quede más claro. Entonces, Este es el proceso. Entonces, bueno, hicimos la extracción. La extracción aparece aquí en este proceso. Hicimos la PCR. La PCR tampoco porque usted ya lo vio, ¿sí? Después del proyecto de PCR es que vamos a hacer esta reacción que se llama la fase de secuencia. La secuencia ciudad es muy similar a una PCR otra vez, pero diferente, tiene un, digamos que un pulso, ¿listo? O sea, básicamente es como si hicieran dos PCRs, una que es la PCR real y otra PCR debutante, que es como tal la reacción de secuencia, ¿listo? Que es la que vamos a ver en este video, ¿listo? Entonces, ¿qué vamos a necesitar? Obviamente el ADN, vamos a necesitar nuestras bases, que son nuestros como ladrillitos, vamos a necesitar un solo primer, vamos a necesitar el ADN a polimerasa. Si ven que es muy similar a la reacción de PCR, pero aquí vamos a utilizar otro factor, otro componente, que se llama las bases terminadoras o los diodos sinucleotidos. ¿Listo? Que son nucleotidos... especiales, ya vamos a ver, y que están marcados con un clorocromo, si ven que tienen como una puntita aquí, entonces necesitamos dos tipos de bases, unas que son normalitas, que son las mismas con las que hacemos la PCR, y otras que son diferentes, que están marcadas con un clorocromo, y si ven, hay cuatro colores diferentes, porque cada una de estas va a corresponder a una base nitrógena diferente. ¿Listo? Entonces lo primero que hacemos siempre es que vamos a separar la hebra y agregamos un solo frente, eso también es importante. Nosotros le aplicamos el primer. Y la polimeraza empieza a polimerizar, o sea, a poner las bases complementarias. Ven que todo esto son los estudios normales, ¿cierto? Pero miren que de forma aleatoria el pulpo puso una base terminadora que está marcada con un clorocromo, ¿sí? Eso digamos con el primer ciclo. Entonces, ¿qué pasa? Se vuelve a naturalizar. Y se vuelve a abrirla. Llega luego otra vez el primer. El mismo primer. Y empieza otra vez a polimerizar. Pero esta vez miren que este terminador quedó mucho más cortito. ¿Sí ven? Y así sucesivamente este proceso se hace múltiples veces. Miren que aquí ya puso uno verdecito. Miren que al final chicos, ¿qué tenemos? Fragmentos de igual o diferentes tamaños. De diferentes tamaños, ¿cierto? ¿Qué me sirve para separar los fragmentos por tamaño? ¿Qué es la electroforesis? La electroforesis, muy bien. Entonces aquí vamos a tener una electroforesis, pero también una electroforesis especial, que se va a llamar electroforesis capilar. Entonces miren, esto es un capilar, ya se los muestro en la vida real, y ellos van a pasar... los fragmentos de ADN van a pasar por este capilar. Como este capilar es un electroforesis, miren que se van a ir separando por tamaño. ¿Cuáles dirán primero? Pequeños. Los tamaños más pequeños. Esta electroforesis es tan potente que te va a separar un solo par de bases. O sea que si un fragmento tiene 30 y el otro tiene 31, primero va a pasar el de 30, luego pasa el de 31, luego pasa el de 32, luego el de 30. ¿Se acuerdan cuál era la resolución de este electroforesis de la convencional, del de la calosa? Era hasta 50, ¿listo? O sea, máximo podríamos diferenciar tamaños de 50 pares de base, ¿sí? O sea, que miren que hay una gran diferencia, este gel es mucho más específico, me va a separar fragmentico por fragmentico y eso es lo que me va a permitir verlo un clorhidro por un clorhidro. Entonces miren que él me los va a poner en orden de tamaño. y cuando va pasando por el capilar el capilar tiene una región donde va a haber una camarita va a incidir un rayo láser y ese rayo láser va a hacer florecer el fluorocromo Y va a ser detectada la fluorescencia en un dispositivo. Entonces, primero digamos que en la posición 8 detectó la A, en la posición 9 detectó la C, en la posición 10 detectó la G, y así sucesivamente, él va a ir generando la cadena de endodios de acuerdo a la fluorescencia que nosotros hayamos visto. ¿Listo? Vemos que este láser va detectando, pero digamos que ya van pasando en un solo punto. Sí, el láser está quieto, pero acuérdense que como ellos se separan por tamaño, entonces primero pasó el más chiquitico y detectó la posición 9, luego pasó el que tenía 10 posiciones y detectó la posición 10, luego el de 11 y así, o sea, acuérdense que ellos van como infinito, ¿listo? Pero el láser está quietito y la cámara también está quietita. Entonces se va arrefezando y se va terminando la secuencia. Esto se hace hasta que se lea todo el fragmento, que lo máximo son mil pares de bases. Si las pones a 700, 800, pues eso es lo máximo. Digamos que muy rara vez se consigue lo máximo. mayoría de veces te consigues un poquitico menor, 600, 700, 800, pero saben que más de 1000, pues no sucede. Estos colorcitos de bases es lo que nosotros vemos, que vimos en la primera diapositiva y esto se llama un electro... microperograma, ¿listo? Que me va mostrando con la fluorescencia de cada una de esas dos bases. Él ya digamos que el equipo está programado y sabe que digamos que si es azul, que si es verde, esta es base, que si es azul es una C, que si es verde es una A, ¿sí? Eso va a depender de la química que se esté utilizando, ¿listo? ¿Quedó claro el video, chicos? Igual el video está en la plataforma, hay dos videitos, es bueno que vean los dos y si tienen alguna duda adicional, pues me comenten. ¿Pero quedó claro hasta allí? Listo. Entonces ahorita vamos a ver el fundamento. Entonces, recordemos que la polimerasa, ¿qué reconoce en los nutriótidos para seguir polimerizando? El primer. El primer, correcto. ¿Pero qué reconoce el primer? El extremo. ¿El extremo cuál extremo? Ajá, ¿y qué estaba en ese extremo? ¿Otro espima? Claro, entonces, muy bien. Recuérdense que para que la polimerasa se une, tiene que reconocer el extremo hidroxilo o el extremo OH para unirse y seguir polimerizando, ¿cierto? Entonces, esos nucleotidos... nucleótidos raritos especiales que están marcados con fluorescencia y que son nucleótidos terminadores, se van a llamar diodeoxinucleótidos. Y los nucleótidos convencionales, que son los que nosotros usamos normalmente, se van a llamar deoxinocleótidos. oxinucleotidos, ¿listo? Los de oxinucleotidos que son los normales, los convencionales, miren que tienen el grupo OH, o sea que cuando se incrusten estos, pues la polimerasa va a reconocer ese grupo OH y va a permitir seguir poniéndola de vincos al lado, ¿listo? En el caso de los diodoxinucleotidos tienen la característica de que no tienen el grupo OH y solamente tienen un hidrógeno, entonces la polimerasa no va a reconocer y por eso que es... es como un nucleótido terminador o una base terminadora. Como la polimerasa no encuentra ese grupo H, que es como ese grasito estirado, para que se une el siguiente nucleótido, pues simplemente no se va a unir el siguiente nucleótido y allí va a terminar. Entonces, característica principal de esto, que vamos a tener dos tipos de bases, unas que son los deoxinucleótidos y otras que son los diedoxinucleótidos. ¿Cuál es la característica de los dióxido nucleótidos? Que no tienen el... grupo OH y que aparte de eso están marcados con un clorofluoro. Y eso es lo que nos va a permitir visualizar. ¿Qué necesitamos para hacer esta reacción de secuencias? Entonces necesitamos nuestra muestra de ADN, que viene directa de la extracción, ¿a dónde viene este ADN? ¿De qué? de la PCR, recuerden chicos que no es directo la extracción, se hace extracción, se hace PCR convencional y luego se hace esta reacción de secuencia que es muy similar a una PCR pero se llama reacción de secuencia o secuenciación, ¿listo? Entonces, este DNA no viene de la extracción, sino que viene de una PCR previa. ¿Listo? Entonces tenemos este DNA, ¿cuántos primeros agregamos? Uno. Uno. ¿Listo? ¿Y en la PCR convencional cuántos primeros agregamos? son unos dos, listo, esto es importante. Agregamos nuestro buffer, que ya sabemos que es lo que nos ayuda a mantener el pH, que tiene el magnesio, sí, todas esas cositas, y los nucleótidos que tenemos, los nucleótidos convencionales que tienen su grupito OH y los nucleótidos diferentes o específicos de la secuenciación que no tienen grupo OH y que están marcados con qué? Con un clorofluoro. Listo, y el clorofluoro tiene que ser diferente pues para cada uno de los... Todo esto se pone en un termociclador que va a hacer, como ya vieron en el video, todos los ciclos de naturalización, hibridación, extensión, varias veces. ¿Listo? ¿Qué es lo que va a pasar? Digamos que... adentro en ese termociclado. En ese termociclado lo que va a pasar es que se va a pegar el primer, tenemos nuestros nucleótidos normales y nuestros nucleótidos marcados y vamos a ir generando diferentes fragmentos de... diferentes tamaños. Acuérdense que estos fragmentos de diferentes tamaños van a tener siempre el nucleotido final va a estar marcado con el fluorocromo porque es aquel que impidió que cortó, que hizo como la señal terminal. Y luego, después de que nosotros sacamos esto del termociclado, que es como nuestro ornito, lo pasamos a otro equipo, tal cual como hicimos en la PCR convencional, que ustedes les pasaron y luego lo pusieron en electroforesis, ¿sí? Entonces nosotros lo sacamos de allí, lo vamos a poner en una plaquita, y esa plaquita es un equipo que se llama equipo de electroforesis capilar, que es una electroforesis mucho más avanzada, y que lo que va a hacer es separarnos los fragmentos, ¿por qué? por tamaño. Entonces, el primero que va a pasar siempre son los más chiquiticos, recuerden que siempre migran los más pequeños primero, y se van a ir, pues, digamos que leyendo las diferentes florescencias, y esa florescencia va a ser traducida en diferentes picos de señales. ¿Es claro, chicos? No, el equipo, ya lo mismo. Esto es un capilar. Esto es un capilar, ¿listo? Entonces si ustedes ven, ¿se acuerdan la camarísima que nosotros teníamos de electroforesis convencional? Dentro de cada uno de estos capilares, hagan de cuenta que está el polímero, que es como si fuese el agar. así que lo que nos separaba por tamaño entonces dentro de cada uno de estos estos digamos que estos hilitos son cojitos y dentro de eso está el polímero por ahí es que va a ir migrando cada una cositas y si ustedes ven esta región de aquí, pues esto obviamente va dentro de un equipo. Entonces ella, una de las partes del equipo, ilumina el láser y la otra detecta la señal de fluorescencia. Todo eso se transmite al equipo y en el equipo es donde nosotros vamos a ver el electroperograma. Entonces, ¿cómo funciona esto? Para que ustedes se hagan una idea Más clara de eso. Resulta que salió de nuestro termociclado la reacción de seco, dice así, y nosotros los ponemos en estas plaquitas. Cada tubito, cada huequito es una muestra. ¿Listo? ¿Qué hace el equipo? Obviamente todo esto está entre un equipo, pero pues estas son como las partes más importantes. Él coge, inyecta y absorbe una cantidad súper chiquitica, como creo que son 5 microlitros que él absorbe, si no estoy mal, que es la décima parte de una gotica. O sea, un volumen muy pequeñito, ¿sí? Y cada muestra va a migrar por un capilar, ¿sí? Él va a ir migrando y la fluorescencia va a ser... detectada por esto porque aquí está el láser aquí está la cámara y todo este equipo está conectado computador sí cuando él va migrando el bar detectando en el computador esta señal y al final como resultado el electrofotograma O sea, no lo dañan, pero igual lo pueden dañar. O sea, esto es un repuesto. Digamos que estos equipos son muy costosos. Todo lo que es de biología molecular es muy costoso. Entonces, por lo menos el equipo electroporesis capilar, que es donde va insertado eso, cuesta como 700 o 1.000 millones de pesos aproximadamente, dependiendo del cambio y cómo esté el dólar. Y este capilar, solo el capilar, lo que ven azulito con esas cositas, es un consumible. O sea, es algo que se tiene que ir gastando cae X tiempo y cuesta aproximadamente unos 12 millones de pesos. Entonces ese ya es uno que cumplió su ciclo y pues ya lo pueden por eso visualizar, pero si no, costaría eso. ¿Listo? Entonces ahí se ve como la parte de la camarita. Cuando veamos el laboratorio de genética, hacemos como tal la visita al laboratorio para que ustedes vean cómo funciona el equipo de Sequenciación Sanger, cómo funciona el Minayon, que lo vamos a ver más adelante, y tengan como mejor el concepto y el Gracias. programa completo, ¿listo? Entonces, mientras que ustedes lo van rotando, ya vimos el video. Chicos, ¿hasta allí quedó todo claro? ¿Sí? Entonces rebobinemos. ¿Quién me hace un resumencito así de cuál es el fundamento? Dos personas, uno cuál es el fundamento, o sea, cuál es la base de la técnica y el otro cuál es el paso a paso, así como a nivel de laboratorio. Pues la base de la técnica sería evaluar como base por base de cómo están ordenadas. Y pues ese sería como el objetivo y pues para eso se utilizaría Preslab, pues ya los fragmentos que sacan de la PCR y pues en el siguiente paso usarían pues algo parecido pero pues con las bases terminales. que tienen como el fluorescente que cuando pasan por este tipo de electroforesis se filtra muy específicamente y con el láser uno puede mirar. Muy bien, excelente. ¿Y qué me dice el paso a paso del flujo de laboratorio? ¿Qué tengo que hacer primero? Llegó el paciente, ¿qué se le hizo al paciente? Sí, la muestra. ¿Qué muestra le vamos a tomar a este paciente? La que ustedes quieran, o sea, de sangre, muy bien. Luego, ¿qué se hizo? Primero se extrae, se extrae la ADN, luego la PCR. Después de la PCR, ¿qué seguía? La PCR siempre venía a mí a qué? A electroforesis. A electroforesis. La electroforesis nos dio un check, no se nos contaminó el blanco, ¿listo? O sea, que sigamos, ¿qué seguiría allí? Sí, pero todo eso se hace en... Sí, entonces sacamos la del producto PCR y la del propósito anduchero. Entonces allí hacemos la reacción de secuencia, que es agregar todo ese mix, hacer como toda esa sopita de secuencia, ¿listo? Y cuando salió de eso, allí si sigue, pasa por el capilar. Reacción de secuencia. Gracias. Perfecto, entonces, vamos a hacerlo en pasos grandes. Primero la toma de muestra, ¿cuál fue la que ustedes quieran? ¿Sangre, saliva, dependiendo de un tumor, dependiendo de lo que nosotros biopsia, o sea, de lo que vayamos a extraer? Luego sigue la extracción de nuestro material genético, ¿ya? Que puede ser ADN o RNA, pues dependiendo también de lo que queramos hacer, ¿listo? Luego esta extracción de ADN, ¿qué sería? La PCR, ¿no? ¿Cuál PCR? La convencional, ¿sí? Que siempre va ligada a una electroforesis convencional. Acuérdense que esto siempre es un punto de chequeo, ¿sí? Y básicamente, después de esto, sigue la secuencia, que también se hace en el termociclador. ¿Qué es la secuencia? Cuando nos hablamos de la secuenciación o la reacción de secuencia, es lo que ustedes dijeron, agregar los deoxinucleótidos, agregar los nucleótidos, agregar la polimerasa, o sea, agregar todo en ese tubito y ponerlo en el termociclador para que el termociclador abra, se pare, extienda, así, todo eso, ¿listo? Diferencias, acordemos que aquí utilizamos dos, y en esta agregamos, ¿cuánto? Un solo primer. Listo. Después de esta secuencia, ¿sí? Que nosotros hacemos el termociclado, lo ponemos en esa plaquita que ustedes vieron allí y hacemos algo que se llama la electroforesis capilar. Y esa electroforesis capilar, ¿qué nos va a dar? nos va a dar el electrogerograma que es esto pues con diferentes colores y luego lo que nosotros vamos a proceder a hacer es el análisis de resultados Chicos, es claro hasta allí todo. Es importante que lo tengan... ¿Pueden integrar un bit? Ah, el electroperograma. Acuérdense que un pico es como un pico de cada color, ¿no? Si no quieres que lo para, no cambia. Es lo que vimos, es esto. ¿Listo? Señora. Para la PCR se tiene que hacer una electroperióloga. Sí, pero recuerden que cuando nosotros hacemos la PCR, nosotros sacamos el tubito y nosotros aquí no sabemos si nos dio o no, porque es muy poquitito. Entonces la PCR siempre se hace para ver que si nos amplificó, que no se nos haya quitado nada, o sea que es nuestro punto de chequeo. ¿Listo? ¿Todo claro chicos hasta allí? Listo. Entonces ya salimos nuestro electrodeferograma, ya pasamos toda nuestra parte que venía siendo nuestra parte laboratorio. Entonces ahorita vamos a hacer una parte que es la que de pronto ustedes más les interesa, que es el análisis de resultados. ¿Listo? Entonces vamos. El análisis de resultados se hace con un análisis con un software específico que es como recolectar la información. ¿Listo? Y nos va a dar estos valores. ¿Sí? Nos va a dar el electroferograma, pero mire que vamos a tener diferentes partes en nuestra pantalla. ¿Listo? Tenemos una parte que es donde aparece nuestro núcleo. Entonces mira, tú ves que el verde se corresponde a la A, el G se corresponde al negrito, azul a la C, ¿sí? Eso ya está como determinado. Pero chicos, usted, entonces, ¿A qué significaría? G, C, T y R, ¿qué significaría? Ok, yo tampoco sé qué es R, nadie sabe qué es R, pero entonces miremos aquí, ¿qué ven aquí? Bueno, se han registrado dos bases. ¿Qué color es B? Verde. Entonces, ¿qué habría aquí? Ajá, pero entonces, ¿verde qué es? Adelina. Y G es guanina, ¿sí? Entonces, si ustedes ven en esta parte, hay dos picos. Como hay dos picos, él dice, mire, esto es una base con picos o lapadas y te la denota con otra letra que no hay ni A, ni T, ni G, ni C. ¿Listo? Ya les digo qué significa porque no me la sé de memoria qué significa. Pero uno simplemente ve el electroferograma y pues sin necesidad de saber qué significa la R, tú ya estás viendo que hay una adenina y que hay una guanina. Es importantísimo siempre revisar... la imagen, porque a veces el software se equivoca, entonces nosotros tenemos que revisar para ver si lo que me está diciendo el software realmente lo estoy visualizando en el análisis, o sea que eso es como algo súper importante. Y adicionalmente aquí hay unos valores, 55, 58, 41, ¿sí? Esto se va a conocer como escala de FRED y es un valor de calidad y ya se lo voy a mostrar. Entonces... Básicamente, el electrofotograma... Ah, bueno, otra cosa importante, los electrofotogramas se presentan en dos tipos de archivos. Archivo AVI o archivo FASTA, que son los dos tipos de archivos que se generan en este caso, ¿listo? Por eso cuando a usted le llegue un archivo AVI o un archivo FASTA, entonces ya van a saber de dónde viene, de qué tipo de prueba puede venir ese archivo, ¿listo? Sí, sí tiene, sino que... Sí, sino que espérate que está casi... Aquí. La R significa A-O-G, la W-A-O-T. Ah, ya, ya, ya. O sea, sí tiene como algo, pero digamos que no hay necesidad que se lo aprenda. Yo la reclamo como que no sé. Sino que es necesario que mire. O sea, ya saben que si es una R, pues no hay ni una N. ...de una guanina, de una tinina, de una citosina, entonces ustedes tienen que buscar que en el electrogerograma que es en la imagen, cuáles son los picos que se están visualizando, ¿listo? Y así ustedes van a saber qué es lo que está diciendo, ¿listo? ¿Es claro hasta allí chicos? ¿Qué tipo de archivos es el que manejamos? AVI o FASTA. Los valores arriba, ya te explico. Es tu colorcito de aquí. ¿Sí? Es un valor de aquí. En la calidad, ya por eso cambié la presentación, todos los sistemas de secuenciación estiman la probabilidad de que cada uno de los nucleotidos secuenciados sean errores. Eso es algo, pues como un control de calidad interno de ellos, ¿listo? Lo que nosotros siempre esperamos... esperamos es que estos números de acá arriba sean mayores a 30. Cuando son mayores a 30 significa que hay una buena calidad en la secuencia. Y esto es una escala logarítmica que se llama frame score. ¿Listo? Entonces, si esta mayoría... 30 significa que la probabilidad de que esta base que ya detectó como a si es de un 1000 de que se arrolla o sea eso no es un error si es 40 es de 1 en 10 mil en este caso es de 55 o sea es como más de 1 en 100 mil viene como 1 en 500 mil listo entonces eso es lo que significa esos valores y nosotros nos está diciendo y si tú lo ves a nivel de imagen mira que es muy claro de que es una Mira que, o sea, eso no tiene pérdida. Pero ustedes ven esta R, como tiene dos picos, mire que la calidad baja 30. ¿Sí? La R está en 30 porque tiene dos picos. Y entre más chiquitico, digamos, sea como el piquito, él también puede ir bajando el nivel del score. O cuando hay mucho ruido de fondo, también puede bajar el nivel de calidad. ¿Listo? ¿Qué significa? Ok, eso es un, digamos que eso es una, es un algoritmo de probabilidad que hace el equipo para controlar la calidad, ¿listo? Lo que significa es la probabilidad de que esa base detectada sea un error. ¿Listo? Entonces, si tú lo ves aquí está el fresh score cuando te aparece que es 10, significa que una probabilidad de 1 en 10 de que sea un error es una probabilidad muy alta de error y no nos funciona cuando es de 20 es de 1 en 100 sería 1 en 1000, que ya es mucho más aceptable. Lo ideal es que esté por encima de 30. Y en el ejemplo que yo les mostré allí, está en 55, que viene siendo una probabilidad aproximada de 1 en 500 en 1000. O sea, que significa que por ahí no es un error, o sea, es algo que es viable. ¿Listo? Chicos, ¿es claro la calidad? Entonces chicos, si ustedes ven este electro programa, pues se ve muy bonito y es muy fácil de analizar y ojalá todos salieran así de bonitos, pero esa no es la realidad. Lastimosamente a veces ocurren cosas, como estas, ¿ya? Entonces si ustedes ven esto, tiene unas N's. significa que el equipo definitivamente no pudo detectar qué es lo que pasaba allí. Y si ustedes ven, digamos que tú no puedes saber aquí cuál iba primero, cuál iba segundo, porque está muy solapado. Entonces estas son secuencias, en este caso mira que está todo muy solapado, entonces es como que si hubiera muchas bases en un solo lugar y tú no puedes discernir cuál corresponde a cada ubicación. Y en este caso miren que la señal de fluorescencia es muy chiquitica, entonces es como una florescencia basada, ¿sí? O sea, no descansamos a visualizarlo bien. ¿Cuáles pueden ser estos problemas de ser en la secuencia? Que no había cebador, o sea, que no había ADN molde, o sea, que pronto no hicimos la electroforesis, y como no hicimos la electroforesis de nuestra PSR convencional, montamos la reacción de secuencia y pues resulta que no agregamos. O se nos olvidó de agregar la muestra, ¿sí? Que no, bueno, que no había el ADN molde, que no agregamos el primer. Entonces teníamos que agregar, o que agregamos un primer en el ronin, digamos que el amplicón de PCR era para el gen HBB y agregamos un priming para el gen FZD4, pues no nos va a hacer porque no está en nuestra región de interés. Que el cebador no ha reconocido el molde. Pues lo mismo que les di. Entonces en este caso no hay señal. Entonces se ve así. Miren que no hay señal. O a veces ni siquiera se ve esto. O sea, se ve totalmente plano. ¿Listo? La señal es muy débil. Entonces había poco ADN en el molde. Entonces tenemos que agregar más cantidad. El cebador no ha reconocido bien el molde. Entonces tenemos que modificar el primer. A ver si el primer sí se está uniendo. A ver si la temperatura de anillamiento es la correcta. así y eso nos daría una señal muy Cuando es muy débil también es muy difícil de leer, entonces pues no es loco. Digamos que en este caso hay genes que son muy similares, que se conocen como cetogenes. Entonces cuando se hace el diseño de primers uno tiene que ser súper específico. ¿Se acuerdan cuando vino un PCR convencional que a veces había como dos banditas y entonces era como inespecificidad en los primers? No, en el electrophoresis no. Estoy segura que sí. Estoy segura que ya se lo dieron. Cuando uno enseña los problemas, los problemas tienen que ser específicos. Eso lo hemos hablado muchas veces, que tienen que ser específicos los problemas con la regla de interés. Si ellos no son específicos, pues puede ser que tengamos dos fragmentos. ¿Qué pasa si tenemos dos fragmentos? Entonces vamos a hacerlo en este lado. Digamos que hicimos unos primers inespecíficos, ¿cierto? Y nuestro primer, y ese primer tenía tres fragmentos. Primer fragmento, segundo fragmento y tercer fragmento, ¿sí? Entonces resulta que este primer fragmento, esta era la secuencia del primer fragmento, esta era la secuencia del segundo fragmento, y esta era la secuencia del tercer fragmento. ¿Qué va a pasar? ¿Qué cree que usted va a pasar cuando veamos la electroforesis capilar? Todo se va a solapar, ¿sí? O sea, ¿no? ¿No? Ok. Esperen, chicos, atentos, atentos. De nuevo, chicos, hola. Los primers en la PCR tienen que ser específicos. Nosotros solo tenemos que amplificar un fragmento, por eso es tan importante el diseño de primer y visualizar la PCR. Si nosotros por error en la PCR no verificamos el gel de electroporesis o diseñamos unos primers mal diseñados, puede ser que en un solo tubito tengamos tres fragmentos diferentes. diferentes, ¿listo? Si nosotros tenemos tres fragmentos diferentes y los agregamos todos en la región de secuencia, ¿qué va a pasar a ser la secuencia? La secuencia vamos a tener tres diferentes para cada uno, entonces el electroferograma me va a detectar tres señales al tiempo, entonces me puede detectar. En la primera posición, esto así. En la segunda posición, otra vez esto así. ¿Sí? Y si yo veo algo así, que es como algo de esto que yo estoy visualizando así, yo no puedo discernir cuál es el pico que me corresponde a cada una de las secuencias. porque entonces hola sí entonces allí es donde yo sé que está mal y que tengo que repetir la secuencia porque en este caso no está siendo específica aquí me va a aparecer otra vez un poco de picos y me van a aparecer típicos de creer diferentes colores, todos solapados, y yo no voy a saber qué parte me corresponde a cada secuencia. Lo que yo necesito saber es el orden de mis nucleótidos. ¿Es claro allí, chicos? Sí, no, más o menos. No, esto es un error, o sea, esto es un error, esto es algo que no tiene que pasar y es un caso hipotético. En este caso, los primers no fueron específicos y me amplificaron fragmentos de diferentes, o sea, de diferentes fragmentos. pero diferentes fragmentos como no se hizo la verificación correcta todos estos fragmentos se secuenciaron y como solo nos dan el electroferograma pues él nos va a poder poner diferentes fluorescencias en un pico y por eso esta secuencia se se ven como así, como medio solapada, como que mire que yo no sé aquí cuál. O sea, es como si fuera, si ustedes ven estas secuencias, es como si hubiesen dos secuencias diferentes pegadas. Y yo no puedo discernir cuál es la de mi interés. Y esto puede pasar por eso. Entonces les di el ejemplo de por qué se podía visualizar así. Eso es aleatoriedad, acuérdense que la polimerasa se le sienten unos nucleótidos de forma aleatoria, entonces siempre va a haber como unos piquitos más altos que otros, pero no importa el alto del pico, mientras que la calidad esté bien, uno lo lee bien. ¿Listo? Entonces en este caso la señal y la resolución son buenas, pero hay varias bandas en cada posición, el cebador se une a varias posiciones del molde, que es lo que les dije, se están secuenciando varios productos, que es el mismo ejemplo que les di, los elevadores de la PCR original no se han eliminado, se nos ha hecho una procesión de purificación. Entonces todo esto nos puede dar como estas inespecificidades de la señal. Hay otros problemas en la secuenciación, que puede ser un gran pico que rompe la secuenciación en un punto concreto, esto de aquí, y esto se puede dar como por procesos de purificación que no se han hecho de forma adecuada. Cuando nosotros vemos una secuencia, chicos, que está bien grande, que tiene una buena señal y de un momento a otro define oye, es porque posiblemente se están formando estructuras secundarias. ¿Se acuerdan qué son las estructuras secundarias? Lo de los harpings. Ellos se unen contra ellos mismos, que se forman como horquillas, sirven los dineros, todo eso son estructuras secundarias. Entonces si es una región donde se está generando una estructura secundaria, pues puede ser que me pase estas cosas porque no se está logrando abrir. Por eso hay una disminución tan dramática de la señal. Entonces chicos, ¿qué vamos a analizar cuando analicemos una secuencia? Primero vamos a analizar qué es el señal, dónde comienza la región de buena calidad, dónde termina la región de mala calidad, de buena calidad. Acaba la región de mala calidad de forma brusca. Hay bases mal interpretadas por el base color, que es el análisis del software. O sea, si me aparecía que había una A, pero yo vi una G. Entonces, allí uno tiene que tomar decisiones. Hay mucho ruido de fondo. O sea, si puedo separar base por base o no lo alcanzo a decir. Todas estas cositas son las que tenemos que analizar. Y las aplicaciones pueden ser varias, pueden ser de microbiología, genética, farmacogenética. Entonces, a microbiología la podemos utilizar para la identificación de genes, ¿sí? De genes humanos, perdón, perdón, de genes de... de bacterias como 18S, como 16S, de genes de hongos como es ITS o también lo podemos buscar genes de resistencia que ya están determinados y que son específicos para los microorganismos. pues el tamizaje molecular de exones pequeños o mutaciones puntuales, y en farmacogenética para variantes en farmacogenes, que ya se han asociado por lo menos, hay unas variantes en el gen 1-2 que están asociados con resistencia al fármaco isoniazida, que es para la tuberculosis. Entonces digamos que si hay una variante específica, ya se sabe que el paciente puede en algunos casos tener resistencia, en otros casos desarrollar afectaciones hepáticas, ¿listo? Entonces todo esto nos sirve. lo que es la secuencia de su ensayo. Importante recordar que todas estas aplicaciones tienen una gran limitante que es de que vamos a tener fragmentos de hasta mil par de horas. Chicos, si quieren, vayan cinco minutos al baño y volvemos a las 12 y 15 para empezar el juicio. ¿Listo?

El señor te puede decir, mira, aquí hay una, una, ni siquiera se ve, ¿cierto? O sea, es muy pequeñito y no podemos visualizar eso. La secuencia de los ángeles nos va a ayudar a determinar el orden de estos nucleótidos.

¿Con cuál objetivo? Pues con el objetivo de ver cuáles son las variaciones entre una secuencia de referencia y entre la secuencia que nosotros estemos analizando. ¿Listo?

Entonces, vamos a iniciar y vamos a abrir la clase en varios momentos. ¿Listo? Vamos a empezar la clase y vamos a terminar hasta donde veamos secuencias en sangre. Allí vamos a hacer el quiz, o sea, de retiración flexible, hacemos el quiz, que sí es necesario realizarlo, y después de realizar el quiz vamos a descargar. computadores, otros no, igual vamos a hacer el proceso y vamos a crear unos grupos y les voy a mostrar cómo se utilizan unas bases de datos y cuáles bases de datos sí se pueden utilizar en las tablas de unos celulares para que ustedes sepan cómo es el proceso.

¿Por qué? Porque la idea, más que el proceso de IPT es que ustedes entiendan cómo analizar los resultados. Obviamente van a tener que conocer cuál es el proceso y para qué sirve cada técnica porque ustedes son los que en su debido momento van a evaluar o van a enviar la técnica. O sea que tienen que saber para qué sirve cada técnica, cuál es la técnica que van a utilizar y cuál es el resultado esperado o con qué objetivos van a enviar eso. ¿Listo?

Es súper importante que estén atentos a esta clase porque esta es como la base para que ustedes entiendan la siguiente clase, las siguientes dos clases que son secuenciación de nueva generación, Illumina y Nanopore. Si se pierden en esta, vamos por favor diciéndome en qué paso a paso se van perdiendo, porque si no el jueves van a estar. super embolatados, ¿listo? Entonces vamos a empezar Entonces, ¿qué es la secuenciación, chicos? La secuenciación consiste en la determinación del orden que tienen los nucleótidos en un fragmento de ADN Entonces tenemos aquí de nuevo la célula es una célula eucariota recordemos que el ADN está en el núcleo de la célula puede ser enrollado en su forma más condensada como es cromosoma, y cuando nosotros pues digamos que enrollamos ese cromosoma, tenemos una doble hélice de DNA, ¿sí?

Esta doble hélice de DNA está conformada por nucleótidos. Y estos nucleótidos pueden ser adenina, timina, citosina o guanina. Lo que nosotros queremos ver con la secuenciación es cuál es el orden. O sea, si hay una guanina primero, si hay una adenina en el segundo, si hay una timina, si hay una citosina.

Nosotros vamos a ver hoy secuenciación Sanger, que es uno de los tipos de secuenciación. Existen diferentes metodologías para nosotros poder ver cuál es el orden de estos nucleótidos. Y básicamente lo que nosotros queremos obtener es esto. Que me diga que primero hay una G, que luego hay una T, que luego hay una A, ¿sí?

Esto es lo que nosotros queremos lograr al final, que nos dé el orden de esto. ¿Con qué objetivo? Pues con el objetivo de que nosotros luego lo alineemos con una referencia, como al armando un rompecabezas, y no sé si han visto estas imágenes que dicen en contra de las siete diferencias, ¿sí? Entonces, háganle cuenta de eso. Nosotros tenemos una región de ADN que viene así en nucleótidos, en K, A, C, D, T, y nosotros encontramos la diferencia.

contra una referencia ya lo vamos a hacer el proceso y ya vamos a ver cómo se actualiza entonces entrando un poquito de historia las técnicas de genética de biología molecular han ido avanzando a lo largo de la historia entonces así como mario bros en el principio tenía una baja resolución y luego los detalles son más específicos y uno podía ver mucho mejor como la calidad de la imagen, básicamente lo mismo pasó con estas técnicas. de biología molecular o de genética. Cuando nosotros iniciamos, la primera técnica en la parte de genética o de biología molecular fue el microscopio de luz.

En el microscopio de luz lo que nos permitía ver eran los cromosomas gigantes, o sea que solamente nos permitía diferenciar entre anectoidías o polifloidías. O sea, por decir, digamos, así tenemos un cromosoma extra, tenemos un cromosoma menos, eso es lo que a nosotros nos permitía visualizar. Pero nosotros no podíamos podíamos ver si un núcleo te ha cambiado, porque veíamos ese cromosoma completo. Luego seguimos con algo que se llamaba un cariótipo de bandeo G, lo cual nos permitía como marcar unas diferentes regiones dentro del cromosoma. Y esto sí nos permitía comparar pero regiones muy grandes, o sea, nosotros podríamos visualizar, digamos que ni se partía toda una colita, si había una lesión muy grande, o si se traslocaba, o sea, Gracias.

ver algunas pequeñas cosas por las diferentes bandas que se marcaba pero igual seguía haciendo algo que podíamos visualizar por mí un microscopio sea algo mucho más grande visto la resolución cuando hablamos de resolución es como ¿Qué tan específico nos permite ver una imagen? No sé si ustedes de pronto vieron en los celulares antiguos que sea un megapíxel, que uno vea como la imagen distorsiona, o los videos antiguos de películas, de lo que sea, que la imagen es como borrosa, como que... que uno no logra ver bien el detalle. En cambio, ahorita, entre mejor sea la cámara, uno le ve el porito, o sea, entonces a eso hablamos de resolución, como que qué tanto podemos ver a detalle, es, digamos, el material genético en este caso, que es lo que estamos evaluando, ¿sí? ¿Es claro eso, el concepto de resolución, chicos?

Perfecto. Entonces, por lo menos en el carácter tipo bandeo G nos permitía visualizar modificaciones desde 5 a 10 megabases. Cuando hablamos de megabases, una megabase es un millón de pares de bases.

O sea que si había una pérdida de 2 millones de pares de bases, la podíamos ver. ¿Sí? Porque, perdón, de 10 millones de bases la podíamos ver. Pero por lo menos, si había una pérdida de 100 mil pares de bases, pares de bases no se iba a ver porque no alcanzábamos a ver el detalle, ¿listo? Luego hay otra técnica que van a visualizar en genética que es la raíz de GH, que es comparativo y que nos ayuda a determinar también regiones grandes, en este caso son como unas sondas enormes y nos va a poder permitir diferenciar de 50 a 100 kilobases, cuando la base de una kilobase son mil bases, o sea que básicamente sería nos permitir diferenciar de 50 mil a 100.000 pares de bases. ¿Es claro, chicos?

Hasta allí. Y esto usualmente es utilizado para algo que se llama análisis de CNV. Cuando llegó la secuenciación Sanger, que con eso fue cuando se hizo todo lo del genoma humano, no sé si escucharon, que ese proyecto duró un mundo de tiempo, como 23 años, que hace poco apenas terminamos de tener como la secuencia de referencia completa, completo así cuando se... esto descubrió la secreción Sanger, nosotros podemos tener la resolución de un par de bases.

¿Qué significaba esto? Nosotros un par de bases no lo podemos ver a microscopio, claramente, ¿sí? Este par de bases nosotros lo vamos a evidenciar en esto, en modificaciones de un nucleótido, o sea, nos va a permitir visualizar si hay un cambio de un solo nucleótido, o sea, si cambia una guanina por una citosina, si cambia una actimina por una anemina, si nos permite ver esa modificación. Por eso la resolución es de un par de bases, ¿ya?

Esta es la técnica que nosotros vamos a ver hoy. ¿Cuál es el inconveniente, o digamos que cuál era la alimentación de la secuenciación Sanyo? Que nos permite analizar pequeñas, ¿ya?

O sea, cuando se hizo por primera vez el genoma, hagan de cuenta que era... Un rompecabezas gigante con piecitas chiquiticas. Entonces, armar eso fue muy difícil porque cada piecita era muy chiquitica, ¿listo?

Entonces, por eso nos demoramos como 20 años. Cada fragmento de la secuenciación Sanger nos permite visualizar a máximo, máximo, mil pares de bases. Esto es un dato importante y anótenlo o ténganlo presente porque eso nos ayuda como a determinar cuándo escoger una técnica o cuándo escoger otra, ¿listo?

Como en la secuenciación Sanger nos permite solamente visualizar pequeños fragmentos, o sea, al máximo mil pares de bases, ¿sí? Se crearon otras técnicas, ¿ya? ¿Cómo son las técnicas de nueva generación? Y entonces allí ya vienen conceptos de panel, de exome y de genoma, que vamos a ver mejor en las próximas clases.

Y básicamente la diferencia entre panel, exome y genoma, más que el panel, no es específico para ágenes. como para un grupo de genes específicos relacionados con una patología puntual, los exomas están relacionados simplemente con regiones codificantes, exoma viene del exón, y acuérdense que los exones son las regiones que codifican. Mientras que el genoma es lo que ahorita se hace con mayores fines de investigación, incluye todo, incluye los intrones, incluye los exones, porque acuérdense que cuando veíamos el dogma central de la hidroquía molecular, decíamos que había un par de...

martes que estaban alejados que eran promotores, que si había modificaciones en los intrones pues podían afectar por el esplaxi, entonces por eso es digamos que mucho más difícil el análisis porque hay más información, nos está dando todo, exones, intrones, promotores, todas las regiones, pero pues digamos aunque es más difícil el análisis tenemos una mayor cobertura. el panorama real, ¿listo? Igual, tranquilos chicos, que esto lo vamos a ir visualizando poquito a poquito, esto es como un panorama general para que vean cuáles son las diferentes técnicas que hay.

Entonces resulta que pues como ya vieron, hay un amplio tipo de pruebas diagnósticas genéticas. Entonces ustedes dirán, bueno profe, ¿y nosotros cómo sabemos cuáles son las pruebas a enviar y en qué momento enviarlo? genética, pues ya le han ido orientando en algunas cosas de cuáles son las pruebas para usarlo, pero aquí queremos que más que se lo aprendan de memoria, es que aprendan el por qué utilizo una, por qué utilizo la otra, o si en algún caso puedo cambiar de prueba sin ninguna consecuencia. secuencia, ¿listo?

Entonces, tenemos diferentes tipos de mutaciones. ¿Cuándo hablamos de una mutación? Nosotros hablamos de una mutación cuando hay una variación en nuestra secuencia de referencia.

¿Es claro eso hasta allí? ¿Es claro lo que es una mutación, chicos? Entonces, pueden haber mutaciones que se conocen como SNPs o pueden haber mutaciones que no son SNPs. Cuando hablamos de SNPs, son variantes o polimorfismos de un solo nucleótido. O sea que el cambio va a ser de un solo nucleótido o de poquitos, o sea, chiquititos.

Y tenemos unas perdidas y renancias de materiales genéticos, o sea que son regiones enormes de lo que hablábamos, de una megabase, de cien kilobases, que son mucho más grandes, ¿listo? Esos son como los dos tipos grandes de... Lo primero que nosotros vamos a pensar.

Cuando estamos hablando de seis o variantes, puede ser que tengamos una mutación puntual o bien conocida. Entonces yo les digo un ejemplo. Si estamos hablando de un paciente. que ya tiene un diagnóstico genético, ¿sí?

Que ya sabemos que tiene algo y que tiene una variante puntual, ¿listo? Y vemos que tiene un hermanito y el hermanito nace exactamente con el mismo fenotipo, entonces nosotros lo primero que vamos a hacer, pues no vamos a pensar en un síndrome nuevo, ¿no? Lo primero que vamos a hacer es confirmarle si realmente tiene lo mismo el hermano, ¿listo?

Entonces en ese caso, como es una mutación puntual, pues ya hacemos específicamente para esa mutación puntual. Otro caso, por lo menos cuando estamos hablando de enfermedades autosómicas recesivas, ¿sí? El estudio de portadores. ¿Saben qué es un portador? ¿Saben qué es autosómico recesivo?

¿Saben qué portador? Siempre me lo expreso. Exacto. Entonces, acuérdense que cuando hablamos de autosómico recesivo es una enfermedad que necesita que los dos alelos estén afectados para que sucese la enfermedad. ¿Sí?

¿Hasta ahí estamos todos claros? Listo. Entonces, como dijo Juan José como dijo Juan José entonces en este tipo de enfermedades es muy importante hacer estudios de portadores para uno determinar cuál es el porcentaje digamos de probabilidad que tiene de tener a tu hijo afectado de saber si el hermano digamos del paciente tiene probabilidad de tener un hijo afectado o en estudios digamos de consejería genética saber si ambos tienen la probabilidad o no de tener hijos afectados como dijo Juan José, un portador es aquel que tienes solo una copia afectada, o sea, tiene el gen, lo puede transmitir, pero no está expresando la enfermedad porque el otro alelo está bien. ¿Es claro eso hasta allí, chicos? ¿Sí?

Listo. Hay genes, digamos, que son relacionados con fenotipo, entonces se hacen paneles de genes, entonces por lo menos, un ejemplo, ¿qué tiene una cardiopatía? Entonces cuando nosotros hacemos un panel de genes y cogemos todos los genes que se han relacionado con Gracias. y lo evaluamos, solamente esos genes, ¿ya? Eso nos ayuda como a ampliar el panorama, pero a tenerlo como solamente enfocado en ese fenotipo, si el fenotipo es muy específico.

¿Listo? O tenemos desconocimiento de genes relacionados con el fenotipo. Entonces resulta que hay algunos casos donde el fenotipo es demasiado polisindrómico, o sea, tenemos demasiadas cosas. Tenemos afectación cardíaca, afectación en los ojos, afectación en la piel, afectación en múltiples lugares, entonces pues no podemos hacer como un panel, porque incluiría a todos los genes. En esos casos específicamente es cuando se recomienda hacer un exoma.

¿Listo? ¿Por qué? porque vamos a incluir todas las reglas. regiones exómeras codificadas. Si ya vemos que el exoma definitivamente no nos funciona, pues haríamos un genoma que va a arcar mayor cantidad de genes.

¿Listo? Por otra parte, cuando estamos hablando de pérdidas o ganancias de material genético, podemos hacer regiones clomosomas específicas, como es el FISH o el MLPA, que son técnicas que van a revisar ustedes específicamente en genética, o podemos hacer un gen... o evaluar el genoma completo mediante raíces GH, que también es una técnica más genética que también van a visualizar en la asignatura de genética. Entonces chicos, solo para rebobinar, cuando nosotros estemos hablando de mutaciones puntuales, estudios de portadores, cuando vayamos a confirmar una variante, cuando sea algo muy específico vamos a utilizar secuenciación Sanger, ¿sí? Porque secuenciación Sanger solamente nos va a permitir ver el orden de los nucleótidos máximo de cuántas?

De mil pares de bases. Y acuérdense que el genoma tiene tres billones de pares de bases. o sea que si nos ponemos a secuenciar todo con con Sanger, pues nos demoramos 20 años como se demora el proyecto genoma humano y pues eso no sería beneficioso para nosotros, ¿sí?

Pero si nosotros queremos ver algo específico, una región puntualcita, por lo menos una nene de cerdas falsiformes, que es dada por una mutación específica, entonces sabemos que allí sí evaluamos secuenciación Sanger, porque solamente si hay 2.000 pares de bases, si vemos y en esos 1.000 pares de bases está la mutación de nuestro interés. Entonces, secuenciación Sanger, mutación puntual, gen conocido, estudio del portador. ¿Listo chicos? Entonces, existen diferentes tipos de secuenciación. La secuenciación ha ido avanzando.

La primera que les comenté fue de la secuenciación Sanger, o de las que vamos a hablar hoy, pero también hay unas secuenciaciones que son de segunda generación. o de tercera generación. ¿Listo?

La de hoy es secuenciación Sanger de primera generación. Esto es importante que lo tengan en cuenta. La secuenciación de segunda generación es Illumina, que la van a ver el jueves.

La tercera generación incluye Nanopore, que es la que vamos a ver el otro martes. ¿Listo chicos? Entonces vamos a ver cada una, pues la más importante, la más relevante en la historia de la secuenciación, la que más se utiliza.

¿Listo? Obviamente hay diferentes plataformas, pero por lo menos en el caso actualmente las que más se utilizan son para diagnóstico médico, son secuencias en Sanger y Lumina que está super abatada en el ámbito médico y actualmente Orformano porque también está pues bastante... en BOO, por decirlo así.

Cuando nosotros hacemos la secuenciación dependiendo de la tecnología que hagamos de acuerdo del enfoque, entonces tenemos que recordar que Sanger está indicado para una región específica. Yo sé que me vuelvo canciona, pero es importante que diferencien. ¿Listo? Porque eso les va a servir cuando estén haciendo el proyecto final de ustedes.

Saben que si de pronto quieren ver todo el genoma completo de una planta, no sé, medicinal, pues no van a utilizar secuencias de Sanger porque se van a enamorar un montón. ¿Listo? ¿Listo?

O sea, de una vez les digo, metodología errada, o sea, en ninguna parte te van a aceptar esto, ¿listo? Pero si tú me dices, no, lo que pasa es que quiero ver de esa planta solamente porque esta cepa tiene, no sé, el beneficio farmacológico y esta cepa no, ¿ya? Y ya sabemos que está en esta región específica, entonces pues ahí sí pueden utilizar secuencias de ensayo, ¿sí?

O sea, todo depende de cuál sea el objetivo que ustedes quieran abordar, ¿listo? Entonces, varía. Variantes detectadas solamente en regiones codificantes o puede ser en regiones no codificantes.

Variantes por persona. Como es tan pequeña la región del mil pares de bases máximo que vamos a tener, probablemente uno encuentra entre 0, a veces en algunas regiones, pero el promedio es entre 3 a 30 variantes. ¿Listo?

En la región analizada por persona, ¿sí? Porque acuérdense que nosotros tenemos algunos variantes que son patogénicas y otras variantes. que no son patogénicas y que es lo que nos permite ser diferentes entre cada uno de nosotros. ¿Quieres hacer una pregunta?

¿Cómo ha sido el día antes? Ok, recuerda que nosotros aquí estamos viendo el orden de los nutrientes, ¿sí? Entonces, esperen.

Chicos, si tienen preguntas, díganme, que la idea es que aprendan bien, porque ustedes van a hacer un taller sin traplicación y entonces, digamos que ya no los puedo llevar, ¿listo? Entonces chicos, digamos que nosotros tenemos, hay una... de datos que ya existen que son estos de referencia nadie se lo sabe y nadie se lo aprende porque son tres millones de combinaciones innecesario, por eso están los vasos de diálogo.

Entonces este ejemplo me lo voy a invitar, ¿listo? Entonces digamos que estamos evaluando el gen HBB que es de la hemoglobina, ¿listo? ¿Sí?

Entonces resulta que en mi base de datos de referencia dice que para este gen Obviamente el gen es más grande, pero vamos a decir que este es mi gen, esta es la referencia, esta es la que está bien, ¿sí? La ideal, la que todos deberíamos, o la que mala mayoría... de personas debería tener, ¿listo? Esa es la que está en la mayoría de la población.

Porque esa base de datos se hizo como homogeneizando muchos datos, miles de datos de genomas de personas, ¿listo? Entonces, voy a evaluar un paciente ¿Sí? Y resulta que este paciente tiene una A, una T, una C, una G, y aquí tiene una G, una A, una T y una G.

Mire que esto está igual, esto está igual, esto está igual, estos están iguales a los de referencia, ¿sí? Pero en este caso, ¿qué pasó? Hay una mutación, hay una variante.

¿Por qué? Porque mire que debía haber una T y hay una G. O sea que eso es una variante. Esto es una variante.

Esta está bien, esta está bien, esta está bien, ¿sí? Entonces mire que el resto de datos está bien. Entonces diríamos que en esta secuencia ¿cuántas variantes hay? Una sola variante, ¿cierto? que es la G, una variante.

Recuerden que en secuenciación Sanger este fragmento es de mil pares de bases máximas, ¿sí? Puede ser 400, 500, 600, de acuerdo a cómo uno lo haga, ¿listo? Entonces, por eso es que digo que... uno puede encontrar de 3 a 30 variantes por persona. O sea que en mi fragmento de, o sea, este fragmento de mi par de bases, probablemente voy a encontrar 3 que no coincidan con mi referencia, o 5, o 6, o 7. ¿Sí es claro que es una variante?

¿Aquí qué es importante, chicos? Aquí es algo importante que no todas las variantes, como ya se los mencioné, son patogénicas, no todas las variantes son malas, ¿ya? Y vamos a aprender a evaluar cuando una variante es buena Gracias. y cuando una vez es mala, ¿listo? Ahorita las hacemos un ejercicio, ¿sí?

Entonces, digamos que una cosa es detectarlas y otra cosa es analizarlas y clasificarlas, ¿listo? ¿Hasta allí es todo claro? ¿Sí?

¿Todos? ¿No? Sí.

Bueno, chicas. Entonces. Todo eso hacía parte de las generalidades.

Yo sé que de pronto hay unas cosas que quedan como imprecisas. Vamos a ver secuenciación sangre, la otra clase vamos a ver ilumina y volvemos a tomar las generalidades como para que queden súper claros esos conceptos. ¿Listo?

Para hacer secuenciación Sanger vamos a tener un flujo de trabajo, ¿listo? Cuando digo flujo de trabajo es cuál es el paso a paso hasta yo obtener una secuencia Sanger, ¿listo? Lo primero que tenemos que hacer es que el chico... la extracción de ADN o de ARN, dependiendo de lo que queramos hacer. Recuerden que si es ARN tenemos que hacer una transcriptaza reversa para pasarlo a CDNA.

¿Listo? Pero siempre vamos a partir de... de ADN. Entonces lo primero que tenemos que hacer es la extracción.

¿Listo? Luego tenemos que hacer una PCR convencional. ¿Cuál? La primera que vimos, la que hace por electroforesis, la que uno... visualiza en el ejercicio de agarosa, ¿sí?

Eso es porque nosotros primero tenemos que delimitar cuál es la región de nuestro interés. ¿Recuerdan que cuánto es el máximo tamaño de fragmentos de Sanger? Mil. Entonces nosotros vamos a hacer, tenemos nuestra biblioteca completa que es todo nuestro material general, ¿cierto? ¿Sí?

Entonces cogemos y le sacamos muchas copias a la página 10 que es la de nuestro interés, ¿sí? Y después de sacarle muchas copias de la página y es que nuestra página de interés sí allí si empezamos a ver letra por letra que lo que dice nuestra página 10 entonces acuérdense como ese grupo los primeros traemos el adn luego hacemos una pc recombinación al que sacarle muchas copias al reguento de interés y luego así hacemos la secuenciación sanger que es ver cuál es el orden de esos nucleótidos de esta amplificación de la pc y finalmente hacemos el análisis o la detección Entonces chicos, importante recordar que siempre la secuenciación Sanger tiene una PCR incluida. Por eso cuando digamos PCR convencional, imagino que Lore les dijo que la PCR puede ser la prueba final o puede ser una prueba intermediaria.

Y van a ver en Illumina que se utiliza otro tipo de PCR. En este caso para Sanger es PCR convencional. ¿Listo? Entonces, vamos a ver un videíto primero y ya les explico para que ustedes... Y ya vamos a la teoría, ¿listo?

Entonces, aquí lo que vamos a visualizar es como tal, qué es lo que hacen hace unos años. Yo les subí varios videítos, dos videítos, es bueno que los revisen para que les quede más claro. Entonces, Este es el proceso.

Entonces, bueno, hicimos la extracción. La extracción aparece aquí en este proceso. Hicimos la PCR. La PCR tampoco porque usted ya lo vio, ¿sí? Después del proyecto de PCR es que vamos a hacer esta reacción que se llama la fase de secuencia.

La secuencia ciudad es muy similar a una PCR otra vez, pero diferente, tiene un, digamos que un pulso, ¿listo? O sea, básicamente es como si hicieran dos PCRs, una que es la PCR real y otra PCR debutante, que es como tal la reacción de secuencia, ¿listo? Que es la que vamos a ver en este video, ¿listo? Entonces, ¿qué vamos a necesitar? Obviamente el ADN, vamos a necesitar nuestras bases, que son nuestros como ladrillitos, vamos a necesitar un solo primer, vamos a necesitar el ADN a polimerasa.

Si ven que es muy similar a la reacción de PCR, pero aquí vamos a utilizar otro factor, otro componente, que se llama las bases terminadoras o los diodos sinucleotidos. ¿Listo? Que son nucleotidos...

especiales, ya vamos a ver, y que están marcados con un clorocromo, si ven que tienen como una puntita aquí, entonces necesitamos dos tipos de bases, unas que son normalitas, que son las mismas con las que hacemos la PCR, y otras que son diferentes, que están marcadas con un clorocromo, y si ven, hay cuatro colores diferentes, porque cada una de estas va a corresponder a una base nitrógena diferente. ¿Listo? Entonces lo primero que hacemos siempre es que vamos a separar la hebra y agregamos un solo frente, eso también es importante.

Nosotros le aplicamos el primer. Y la polimeraza empieza a polimerizar, o sea, a poner las bases complementarias. Ven que todo esto son los estudios normales, ¿cierto?

Pero miren que de forma aleatoria el pulpo puso una base terminadora que está marcada con un clorocromo, ¿sí? Eso digamos con el primer ciclo. Entonces, ¿qué pasa? Se vuelve a naturalizar. Y se vuelve a abrirla.

Llega luego otra vez el primer. El mismo primer. Y empieza otra vez a polimerizar.

Pero esta vez miren que este terminador quedó mucho más cortito. ¿Sí ven? Y así sucesivamente este proceso se hace múltiples veces. Miren que aquí ya puso uno verdecito. Miren que al final chicos, ¿qué tenemos?

Fragmentos de igual o diferentes tamaños. De diferentes tamaños, ¿cierto? ¿Qué me sirve para separar los fragmentos por tamaño? ¿Qué es la electroforesis? La electroforesis, muy bien.

Entonces aquí vamos a tener una electroforesis, pero también una electroforesis especial, que se va a llamar electroforesis capilar. Entonces miren, esto es un capilar, ya se los muestro en la vida real, y ellos van a pasar... los fragmentos de ADN van a pasar por este capilar.

Como este capilar es un electroforesis, miren que se van a ir separando por tamaño. ¿Cuáles dirán primero? Pequeños.

Los tamaños más pequeños. Esta electroforesis es tan potente que te va a separar un solo par de bases. O sea que si un fragmento tiene 30 y el otro tiene 31, primero va a pasar el de 30, luego pasa el de 31, luego pasa el de 32, luego el de 30. ¿Se acuerdan cuál era la resolución de este electroforesis de la convencional, del de la calosa?

Era hasta 50, ¿listo? O sea, máximo podríamos diferenciar tamaños de 50 pares de base, ¿sí? O sea, que miren que hay una gran diferencia, este gel es mucho más específico, me va a separar fragmentico por fragmentico y eso es lo que me va a permitir verlo un clorhidro por un clorhidro.

Entonces miren que él me los va a poner en orden de tamaño. y cuando va pasando por el capilar el capilar tiene una región donde va a haber una camarita va a incidir un rayo láser y ese rayo láser va a hacer florecer el fluorocromo Y va a ser detectada la fluorescencia en un dispositivo. Entonces, primero digamos que en la posición 8 detectó la A, en la posición 9 detectó la C, en la posición 10 detectó la G, y así sucesivamente, él va a ir generando la cadena de endodios de acuerdo a la fluorescencia que nosotros hayamos visto.

¿Listo? Vemos que este láser va detectando, pero digamos que ya van pasando en un solo punto. Sí, el láser está quieto, pero acuérdense que como ellos se separan por tamaño, entonces primero pasó el más chiquitico y detectó la posición 9, luego pasó el que tenía 10 posiciones y detectó la posición 10, luego el de 11 y así, o sea, acuérdense que ellos van como infinito, ¿listo?

Pero el láser está quietito y la cámara también está quietita. Entonces se va arrefezando y se va terminando la secuencia. Esto se hace hasta que se lea todo el fragmento, que lo máximo son mil pares de bases. Si las pones a 700, 800, pues eso es lo máximo. Digamos que muy rara vez se consigue lo máximo.

mayoría de veces te consigues un poquitico menor, 600, 700, 800, pero saben que más de 1000, pues no sucede. Estos colorcitos de bases es lo que nosotros vemos, que vimos en la primera diapositiva y esto se llama un electro... microperograma, ¿listo? Que me va mostrando con la fluorescencia de cada una de esas dos bases.

Él ya digamos que el equipo está programado y sabe que digamos que si es azul, que si es verde, esta es base, que si es azul es una C, que si es verde es una A, ¿sí? Eso va a depender de la química que se esté utilizando, ¿listo? ¿Quedó claro el video, chicos? Igual el video está en la plataforma, hay dos videitos, es bueno que vean los dos y si tienen alguna duda adicional, pues me comenten. ¿Pero quedó claro hasta allí?

Listo. Entonces ahorita vamos a ver el fundamento. Entonces, recordemos que la polimerasa, ¿qué reconoce en los nutriótidos para seguir polimerizando?

El primer. El primer, correcto. ¿Pero qué reconoce el primer?

El extremo. ¿El extremo cuál extremo? Ajá, ¿y qué estaba en ese extremo?

¿Otro espima? Claro, entonces, muy bien. Recuérdense que para que la polimerasa se une, tiene que reconocer el extremo hidroxilo o el extremo OH para unirse y seguir polimerizando, ¿cierto? Entonces, esos nucleotidos...

nucleótidos raritos especiales que están marcados con fluorescencia y que son nucleótidos terminadores, se van a llamar diodeoxinucleótidos. Y los nucleótidos convencionales, que son los que nosotros usamos normalmente, se van a llamar deoxinocleótidos. oxinucleotidos, ¿listo?

Los de oxinucleotidos que son los normales, los convencionales, miren que tienen el grupo OH, o sea que cuando se incrusten estos, pues la polimerasa va a reconocer ese grupo OH y va a permitir seguir poniéndola de vincos al lado, ¿listo? En el caso de los diodoxinucleotidos tienen la característica de que no tienen el grupo OH y solamente tienen un hidrógeno, entonces la polimerasa no va a reconocer y por eso que es... es como un nucleótido terminador o una base terminadora.

Como la polimerasa no encuentra ese grupo H, que es como ese grasito estirado, para que se une el siguiente nucleótido, pues simplemente no se va a unir el siguiente nucleótido y allí va a terminar. Entonces, característica principal de esto, que vamos a tener dos tipos de bases, unas que son los deoxinucleótidos y otras que son los diedoxinucleótidos. ¿Cuál es la característica de los dióxido nucleótidos? Que no tienen el...

grupo OH y que aparte de eso están marcados con un clorofluoro. Y eso es lo que nos va a permitir visualizar. ¿Qué necesitamos para hacer esta reacción de secuencias? Entonces necesitamos nuestra muestra de ADN, que viene directa de la extracción, ¿a dónde viene este ADN? ¿De qué?

de la PCR, recuerden chicos que no es directo la extracción, se hace extracción, se hace PCR convencional y luego se hace esta reacción de secuencia que es muy similar a una PCR pero se llama reacción de secuencia o secuenciación, ¿listo? Entonces, este DNA no viene de la extracción, sino que viene de una PCR previa. ¿Listo? Entonces tenemos este DNA, ¿cuántos primeros agregamos?

Uno. Uno. ¿Listo? ¿Y en la PCR convencional cuántos primeros agregamos?

son unos dos, listo, esto es importante. Agregamos nuestro buffer, que ya sabemos que es lo que nos ayuda a mantener el pH, que tiene el magnesio, sí, todas esas cositas, y los nucleótidos que tenemos, los nucleótidos convencionales que tienen su grupito OH y los nucleótidos diferentes o específicos de la secuenciación que no tienen grupo OH y que están marcados con qué? Con un clorofluoro. Listo, y el clorofluoro tiene que ser diferente pues para cada uno de los... Todo esto se pone en un termociclador que va a hacer, como ya vieron en el video, todos los ciclos de naturalización, hibridación, extensión, varias veces.

¿Listo? ¿Qué es lo que va a pasar? Digamos que... adentro en ese termociclado.

En ese termociclado lo que va a pasar es que se va a pegar el primer, tenemos nuestros nucleótidos normales y nuestros nucleótidos marcados y vamos a ir generando diferentes fragmentos de... diferentes tamaños. Acuérdense que estos fragmentos de diferentes tamaños van a tener siempre el nucleotido final va a estar marcado con el fluorocromo porque es aquel que impidió que cortó, que hizo como la señal terminal.

Y luego, después de que nosotros sacamos esto del termociclado, que es como nuestro ornito, lo pasamos a otro equipo, tal cual como hicimos en la PCR convencional, que ustedes les pasaron y luego lo pusieron en electroforesis, ¿sí? Entonces nosotros lo sacamos de allí, lo vamos a poner en una plaquita, y esa plaquita es un equipo que se llama equipo de electroforesis capilar, que es una electroforesis mucho más avanzada, y que lo que va a hacer es separarnos los fragmentos, ¿por qué? por tamaño. Entonces, el primero que va a pasar siempre son los más chiquiticos, recuerden que siempre migran los más pequeños primero, y se van a ir, pues, digamos que leyendo las diferentes florescencias, y esa florescencia va a ser traducida en diferentes picos de señales.

¿Es claro, chicos? No, el equipo, ya lo mismo. Esto es un capilar. Esto es un capilar, ¿listo?

Entonces si ustedes ven, ¿se acuerdan la camarísima que nosotros teníamos de electroforesis convencional? Dentro de cada uno de estos capilares, hagan de cuenta que está el polímero, que es como si fuese el agar. así que lo que nos separaba por tamaño entonces dentro de cada uno de estos estos digamos que estos hilitos son cojitos y dentro de eso está el polímero por ahí es que va a ir migrando cada una cositas y si ustedes ven esta región de aquí, pues esto obviamente va dentro de un equipo.

Entonces ella, una de las partes del equipo, ilumina el láser y la otra detecta la señal de fluorescencia. Todo eso se transmite al equipo y en el equipo es donde nosotros vamos a ver el electroperograma. Entonces, ¿cómo funciona esto?

Para que ustedes se hagan una idea Más clara de eso. Resulta que salió de nuestro termociclado la reacción de seco, dice así, y nosotros los ponemos en estas plaquitas. Cada tubito, cada huequito es una muestra.

¿Listo? ¿Qué hace el equipo? Obviamente todo esto está entre un equipo, pero pues estas son como las partes más importantes.

Él coge, inyecta y absorbe una cantidad súper chiquitica, como creo que son 5 microlitros que él absorbe, si no estoy mal, que es la décima parte de una gotica. O sea, un volumen muy pequeñito, ¿sí? Y cada muestra va a migrar por un capilar, ¿sí?

Él va a ir migrando y la fluorescencia va a ser... detectada por esto porque aquí está el láser aquí está la cámara y todo este equipo está conectado computador sí cuando él va migrando el bar detectando en el computador esta señal y al final como resultado el electrofotograma O sea, no lo dañan, pero igual lo pueden dañar. O sea, esto es un repuesto.

Digamos que estos equipos son muy costosos. Todo lo que es de biología molecular es muy costoso. Entonces, por lo menos el equipo electroporesis capilar, que es donde va insertado eso, cuesta como 700 o 1.000 millones de pesos aproximadamente, dependiendo del cambio y cómo esté el dólar.

Y este capilar, solo el capilar, lo que ven azulito con esas cositas, es un consumible. O sea, es algo que se tiene que ir gastando cae X tiempo y cuesta aproximadamente unos 12 millones de pesos. Entonces ese ya es uno que cumplió su ciclo y pues ya lo pueden por eso visualizar, pero si no, costaría eso.

¿Listo? Entonces ahí se ve como la parte de la camarita. Cuando veamos el laboratorio de genética, hacemos como tal la visita al laboratorio para que ustedes vean cómo funciona el equipo de Sequenciación Sanger, cómo funciona el Minayon, que lo vamos a ver más adelante, y tengan como mejor el concepto y el Gracias. programa completo, ¿listo?

Entonces, mientras que ustedes lo van rotando, ya vimos el video. Chicos, ¿hasta allí quedó todo claro? ¿Sí?

Entonces rebobinemos. ¿Quién me hace un resumencito así de cuál es el fundamento? Dos personas, uno cuál es el fundamento, o sea, cuál es la base de la técnica y el otro cuál es el paso a paso, así como a nivel de laboratorio. Pues la base de la técnica sería evaluar como base por base de cómo están ordenadas. Y pues ese sería como el objetivo y pues para eso se utilizaría Preslab, pues ya los fragmentos que sacan de la PCR y pues en el siguiente paso usarían pues algo parecido pero pues con las bases terminales.

que tienen como el fluorescente que cuando pasan por este tipo de electroforesis se filtra muy específicamente y con el láser uno puede mirar. Muy bien, excelente. ¿Y qué me dice el paso a paso del flujo de laboratorio?

¿Qué tengo que hacer primero? Llegó el paciente, ¿qué se le hizo al paciente? Sí, la muestra.

¿Qué muestra le vamos a tomar a este paciente? La que ustedes quieran, o sea, de sangre, muy bien. Luego, ¿qué se hizo? Primero se extrae, se extrae la ADN, luego la PCR. Después de la PCR, ¿qué seguía?

La PCR siempre venía a mí a qué? A electroforesis. A electroforesis. La electroforesis nos dio un check, no se nos contaminó el blanco, ¿listo?

O sea, que sigamos, ¿qué seguiría allí? Sí, pero todo eso se hace en... Sí, entonces sacamos la del producto PCR y la del propósito anduchero. Entonces allí hacemos la reacción de secuencia, que es agregar todo ese mix, hacer como toda esa sopita de secuencia, ¿listo?

Y cuando salió de eso, allí si sigue, pasa por el capilar. Reacción de secuencia. Gracias. Perfecto, entonces, vamos a hacerlo en pasos grandes.

Primero la toma de muestra, ¿cuál fue la que ustedes quieran? ¿Sangre, saliva, dependiendo de un tumor, dependiendo de lo que nosotros biopsia, o sea, de lo que vayamos a extraer? Luego sigue la extracción de nuestro material genético, ¿ya? Que puede ser ADN o RNA, pues dependiendo también de lo que queramos hacer, ¿listo? Luego esta extracción de ADN, ¿qué sería?

La PCR, ¿no? ¿Cuál PCR? La convencional, ¿sí?

Que siempre va ligada a una electroforesis convencional. Acuérdense que esto siempre es un punto de chequeo, ¿sí? Y básicamente, después de esto, sigue la secuencia, que también se hace en el termociclador. ¿Qué es la secuencia?

Cuando nos hablamos de la secuenciación o la reacción de secuencia, es lo que ustedes dijeron, agregar los deoxinucleótidos, agregar los nucleótidos, agregar la polimerasa, o sea, agregar todo en ese tubito y ponerlo en el termociclador para que el termociclador abra, se pare, extienda, así, todo eso, ¿listo? Diferencias, acordemos que aquí utilizamos dos, y en esta agregamos, ¿cuánto? Un solo primer. Listo. Después de esta secuencia, ¿sí?

Que nosotros hacemos el termociclado, lo ponemos en esa plaquita que ustedes vieron allí y hacemos algo que se llama la electroforesis capilar. Y esa electroforesis capilar, ¿qué nos va a dar? nos va a dar el electrogerograma que es esto pues con diferentes colores y luego lo que nosotros vamos a proceder a hacer es el análisis de resultados Chicos, es claro hasta allí todo.

Es importante que lo tengan... ¿Pueden integrar un bit? Ah, el electroperograma. Acuérdense que un pico es como un pico de cada color, ¿no? Si no quieres que lo para, no cambia.

Es lo que vimos, es esto. ¿Listo? Señora. Para la PCR se tiene que hacer una electroperióloga.

Sí, pero recuerden que cuando nosotros hacemos la PCR, nosotros sacamos el tubito y nosotros aquí no sabemos si nos dio o no, porque es muy poquitito. Entonces la PCR siempre se hace para ver que si nos amplificó, que no se nos haya quitado nada, o sea que es nuestro punto de chequeo. ¿Listo? ¿Todo claro chicos hasta allí?

Listo. Entonces ya salimos nuestro electrodeferograma, ya pasamos toda nuestra parte que venía siendo nuestra parte laboratorio. Entonces ahorita vamos a hacer una parte que es la que de pronto ustedes más les interesa, que es el análisis de resultados. ¿Listo?

Entonces vamos. El análisis de resultados se hace con un análisis con un software específico que es como recolectar la información. ¿Listo? Y nos va a dar estos valores.

¿Sí? Nos va a dar el electroferograma, pero mire que vamos a tener diferentes partes en nuestra pantalla. ¿Listo?

Tenemos una parte que es donde aparece nuestro núcleo. Entonces mira, tú ves que el verde se corresponde a la A, el G se corresponde al negrito, azul a la C, ¿sí? Eso ya está como determinado.

Pero chicos, usted, entonces, ¿A qué significaría? G, C, T y R, ¿qué significaría? Ok, yo tampoco sé qué es R, nadie sabe qué es R, pero entonces miremos aquí, ¿qué ven aquí? Bueno, se han registrado dos bases.

¿Qué color es B? Verde. Entonces, ¿qué habría aquí?

Ajá, pero entonces, ¿verde qué es? Adelina. Y G es guanina, ¿sí?

Entonces, si ustedes ven en esta parte, hay dos picos. Como hay dos picos, él dice, mire, esto es una base con picos o lapadas y te la denota con otra letra que no hay ni A, ni T, ni G, ni C. ¿Listo? Ya les digo qué significa porque no me la sé de memoria qué significa. Pero uno simplemente ve el electroferograma y pues sin necesidad de saber qué significa la R, tú ya estás viendo que hay una adenina y que hay una guanina.

Es importantísimo siempre revisar... la imagen, porque a veces el software se equivoca, entonces nosotros tenemos que revisar para ver si lo que me está diciendo el software realmente lo estoy visualizando en el análisis, o sea que eso es como algo súper importante. Y adicionalmente aquí hay unos valores, 55, 58, 41, ¿sí? Esto se va a conocer como escala de FRED y es un valor de calidad y ya se lo voy a mostrar. Entonces...

Básicamente, el electrofotograma... Ah, bueno, otra cosa importante, los electrofotogramas se presentan en dos tipos de archivos. Archivo AVI o archivo FASTA, que son los dos tipos de archivos que se generan en este caso, ¿listo? Por eso cuando a usted le llegue un archivo AVI o un archivo FASTA, entonces ya van a saber de dónde viene, de qué tipo de prueba puede venir ese archivo, ¿listo? Sí, sí tiene, sino que...

Sí, sino que espérate que está casi... Aquí. La R significa A-O-G, la W-A-O-T. Ah, ya, ya, ya. O sea, sí tiene como algo, pero digamos que no hay necesidad que se lo aprenda.

Yo la reclamo como que no sé. Sino que es necesario que mire. O sea, ya saben que si es una R, pues no hay ni una N. ...de una guanina, de una tinina, de una citosina, entonces ustedes tienen que buscar que en el electrogerograma que es en la imagen, cuáles son los picos que se están visualizando, ¿listo? Y así ustedes van a saber qué es lo que está diciendo, ¿listo?

¿Es claro hasta allí chicos? ¿Qué tipo de archivos es el que manejamos? AVI o FASTA. Los valores arriba, ya te explico. Es tu colorcito de aquí.

¿Sí? Es un valor de aquí. En la calidad, ya por eso cambié la presentación, todos los sistemas de secuenciación estiman la probabilidad de que cada uno de los nucleotidos secuenciados sean errores.

Eso es algo, pues como un control de calidad interno de ellos, ¿listo? Lo que nosotros siempre esperamos... esperamos es que estos números de acá arriba sean mayores a 30. Cuando son mayores a 30 significa que hay una buena calidad en la secuencia.

Y esto es una escala logarítmica que se llama frame score. ¿Listo? Entonces, si esta mayoría...

30 significa que la probabilidad de que esta base que ya detectó como a si es de un 1000 de que se arrolla o sea eso no es un error si es 40 es de 1 en 10 mil en este caso es de 55 o sea es como más de 1 en 100 mil viene como 1 en 500 mil listo entonces eso es lo que significa esos valores y nosotros nos está diciendo y si tú lo ves a nivel de imagen mira que es muy claro de que es una Mira que, o sea, eso no tiene pérdida. Pero ustedes ven esta R, como tiene dos picos, mire que la calidad baja 30. ¿Sí? La R está en 30 porque tiene dos picos.

Y entre más chiquitico, digamos, sea como el piquito, él también puede ir bajando el nivel del score. O cuando hay mucho ruido de fondo, también puede bajar el nivel de calidad. ¿Listo?

¿Qué significa? Ok, eso es un, digamos que eso es una, es un algoritmo de probabilidad que hace el equipo para controlar la calidad, ¿listo? Lo que significa es la probabilidad de que esa base detectada sea un error. ¿Listo? Entonces, si tú lo ves aquí está el fresh score cuando te aparece que es 10, significa que una probabilidad de 1 en 10 de que sea un error es una probabilidad muy alta de error y no nos funciona cuando es de 20 es de 1 en 100 sería 1 en 1000, que ya es mucho más aceptable.

Lo ideal es que esté por encima de 30. Y en el ejemplo que yo les mostré allí, está en 55, que viene siendo una probabilidad aproximada de 1 en 500 en 1000. O sea, que significa que por ahí no es un error, o sea, es algo que es viable. ¿Listo? Chicos, ¿es claro la calidad? Entonces chicos, si ustedes ven este electro programa, pues se ve muy bonito y es muy fácil de analizar y ojalá todos salieran así de bonitos, pero esa no es la realidad.

Lastimosamente a veces ocurren cosas, como estas, ¿ya? Entonces si ustedes ven esto, tiene unas N's. significa que el equipo definitivamente no pudo detectar qué es lo que pasaba allí.

Y si ustedes ven, digamos que tú no puedes saber aquí cuál iba primero, cuál iba segundo, porque está muy solapado. Entonces estas son secuencias, en este caso mira que está todo muy solapado, entonces es como que si hubiera muchas bases en un solo lugar y tú no puedes discernir cuál corresponde a cada ubicación. Y en este caso miren que la señal de fluorescencia es muy chiquitica, entonces es como una florescencia basada, ¿sí? O sea, no descansamos a visualizarlo bien.

¿Cuáles pueden ser estos problemas de ser en la secuencia? Que no había cebador, o sea, que no había ADN molde, o sea, que pronto no hicimos la electroforesis, y como no hicimos la electroforesis de nuestra PSR convencional, montamos la reacción de secuencia y pues resulta que no agregamos. O se nos olvidó de agregar la muestra, ¿sí? Que no, bueno, que no había el ADN molde, que no agregamos el primer.

Entonces teníamos que agregar, o que agregamos un primer en el ronin, digamos que el amplicón de PCR era para el gen HBB y agregamos un priming para el gen FZD4, pues no nos va a hacer porque no está en nuestra región de interés. Que el cebador no ha reconocido el molde. Pues lo mismo que les di. Entonces en este caso no hay señal.

Entonces se ve así. Miren que no hay señal. O a veces ni siquiera se ve esto. O sea, se ve totalmente plano.

¿Listo? La señal es muy débil. Entonces había poco ADN en el molde. Entonces tenemos que agregar más cantidad. El cebador no ha reconocido bien el molde.

Entonces tenemos que modificar el primer. A ver si el primer sí se está uniendo. A ver si la temperatura de anillamiento es la correcta.

así y eso nos daría una señal muy Cuando es muy débil también es muy difícil de leer, entonces pues no es loco. Digamos que en este caso hay genes que son muy similares, que se conocen como cetogenes. Entonces cuando se hace el diseño de primers uno tiene que ser súper específico. ¿Se acuerdan cuando vino un PCR convencional que a veces había como dos banditas y entonces era como inespecificidad en los primers? No, en el electrophoresis no.

Estoy segura que sí. Estoy segura que ya se lo dieron. Cuando uno enseña los problemas, los problemas tienen que ser específicos.

Eso lo hemos hablado muchas veces, que tienen que ser específicos los problemas con la regla de interés. Si ellos no son específicos, pues puede ser que tengamos dos fragmentos. ¿Qué pasa si tenemos dos fragmentos? Entonces vamos a hacerlo en este lado. Digamos que hicimos unos primers inespecíficos, ¿cierto?

Y nuestro primer, y ese primer tenía tres fragmentos. Primer fragmento, segundo fragmento y tercer fragmento, ¿sí? Entonces resulta que este primer fragmento, esta era la secuencia del primer fragmento, esta era la secuencia del segundo fragmento, y esta era la secuencia del tercer fragmento. ¿Qué va a pasar? ¿Qué cree que usted va a pasar cuando veamos la electroforesis capilar?

Todo se va a solapar, ¿sí? O sea, ¿no? ¿No?

Ok. Esperen, chicos, atentos, atentos. De nuevo, chicos, hola.

Los primers en la PCR tienen que ser específicos. Nosotros solo tenemos que amplificar un fragmento, por eso es tan importante el diseño de primer y visualizar la PCR. Si nosotros por error en la PCR no verificamos el gel de electroporesis o diseñamos unos primers mal diseñados, puede ser que en un solo tubito tengamos tres fragmentos diferentes. diferentes, ¿listo?

Si nosotros tenemos tres fragmentos diferentes y los agregamos todos en la región de secuencia, ¿qué va a pasar a ser la secuencia? La secuencia vamos a tener tres diferentes para cada uno, entonces el electroferograma me va a detectar tres señales al tiempo, entonces me puede detectar. En la primera posición, esto así. En la segunda posición, otra vez esto así. ¿Sí?

Y si yo veo algo así, que es como algo de esto que yo estoy visualizando así, yo no puedo discernir cuál es el pico que me corresponde a cada una de las secuencias. porque entonces hola sí entonces allí es donde yo sé que está mal y que tengo que repetir la secuencia porque en este caso no está siendo específica aquí me va a aparecer otra vez un poco de picos y me van a aparecer típicos de creer diferentes colores, todos solapados, y yo no voy a saber qué parte me corresponde a cada secuencia. Lo que yo necesito saber es el orden de mis nucleótidos.

¿Es claro allí, chicos? Sí, no, más o menos. No, esto es un error, o sea, esto es un error, esto es algo que no tiene que pasar y es un caso hipotético. En este caso, los primers no fueron específicos y me amplificaron fragmentos de diferentes, o sea, de diferentes fragmentos. pero diferentes fragmentos como no se hizo la verificación correcta todos estos fragmentos se secuenciaron y como solo nos dan el electroferograma pues él nos va a poder poner diferentes fluorescencias en un pico y por eso esta secuencia se se ven como así, como medio solapada, como que mire que yo no sé aquí cuál.

O sea, es como si fuera, si ustedes ven estas secuencias, es como si hubiesen dos secuencias diferentes pegadas. Y yo no puedo discernir cuál es la de mi interés. Y esto puede pasar por eso.

Entonces les di el ejemplo de por qué se podía visualizar así. Eso es aleatoriedad, acuérdense que la polimerasa se le sienten unos nucleótidos de forma aleatoria, entonces siempre va a haber como unos piquitos más altos que otros, pero no importa el alto del pico, mientras que la calidad esté bien, uno lo lee bien. ¿Listo? Entonces en este caso la señal y la resolución son buenas, pero hay varias bandas en cada posición, el cebador se une a varias posiciones del molde, que es lo que les dije, se están secuenciando varios productos, que es el mismo ejemplo que les di, los elevadores de la PCR original no se han eliminado, se nos ha hecho una procesión de purificación. Entonces todo esto nos puede dar como estas inespecificidades de la señal.

Hay otros problemas en la secuenciación, que puede ser un gran pico que rompe la secuenciación en un punto concreto, esto de aquí, y esto se puede dar como por procesos de purificación que no se han hecho de forma adecuada. Cuando nosotros vemos una secuencia, chicos, que está bien grande, que tiene una buena señal y de un momento a otro define oye, es porque posiblemente se están formando estructuras secundarias. ¿Se acuerdan qué son las estructuras secundarias?

Lo de los harpings. Ellos se unen contra ellos mismos, que se forman como horquillas, sirven los dineros, todo eso son estructuras secundarias. Entonces si es una región donde se está generando una estructura secundaria, pues puede ser que me pase estas cosas porque no se está logrando abrir.

Por eso hay una disminución tan dramática de la señal. Entonces chicos, ¿qué vamos a analizar cuando analicemos una secuencia? Primero vamos a analizar qué es el señal, dónde comienza la región de buena calidad, dónde termina la región de mala calidad, de buena calidad. Acaba la región de mala calidad de forma brusca. Hay bases mal interpretadas por el base color, que es el análisis del software.

O sea, si me aparecía que había una A, pero yo vi una G. Entonces, allí uno tiene que tomar decisiones. Hay mucho ruido de fondo. O sea, si puedo separar base por base o no lo alcanzo a decir. Todas estas cositas son las que tenemos que analizar.

Y las aplicaciones pueden ser varias, pueden ser de microbiología, genética, farmacogenética. Entonces, a microbiología la podemos utilizar para la identificación de genes, ¿sí? De genes humanos, perdón, perdón, de genes de...

de bacterias como 18S, como 16S, de genes de hongos como es ITS o también lo podemos buscar genes de resistencia que ya están determinados y que son específicos para los microorganismos. pues el tamizaje molecular de exones pequeños o mutaciones puntuales, y en farmacogenética para variantes en farmacogenes, que ya se han asociado por lo menos, hay unas variantes en el gen 1-2 que están asociados con resistencia al fármaco isoniazida, que es para la tuberculosis. Entonces digamos que si hay una variante específica, ya se sabe que el paciente puede en algunos casos tener resistencia, en otros casos desarrollar afectaciones hepáticas, ¿listo? Entonces todo esto nos sirve.

lo que es la secuencia de su ensayo. Importante recordar que todas estas aplicaciones tienen una gran limitante que es de que vamos a tener fragmentos de hasta mil par de horas. Chicos, si quieren, vayan cinco minutos al baño y volvemos a las 12 y 15 para empezar el juicio. ¿Listo?

Transcript for:Secuenciación de ADN y técnica Sanger

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Secuenciación de ADN y técnica Sanger