Estudio de las expresiones génicas mediante técnicas moleculares

Estrategias principales

• Identificar en el ADN producto la expresión
• Identificar proteínas

Técnicas para análisis de la expresión génica

Identificación a través del ADN

• Obtener ADN de diferentes tejidos
• Convertir ADN en ADN de doble hebra:
  • Reacciones con enzimas retrotranscriptasa y ADN polimerasa
• Uso de "primers" (fragmentos de nucleótidos):
  • Desnaturalización calórica para separar las hebras de ADN
  • Hibridación del "primer" a una temperatura adecuada
  • Polimerasa copia las moléculas de ADN a 72°C
• Repetición de ciclos para obtener amplificación exponencial
• Análisis en gel de agarosa para separación por tamaño y detección de bandas

Técnicas de cuantificación

• RT-PCR en tiempo real:
  • Uso de fluroforos o de un tercer "primer" con fluoróforo
  • En caso del tercer "primer", la poliomerasa lo degrada liberando el fluoróforo
  • La fluorescencia indica la amplificación del ADN
  • Análisis de ciclos y niveles de fluorescencia

Identificación de genes expresados

Transcriptoma

• Definición: Conjunto de todas las moléculas de ARN mensajero presentes en una célula en un momento determinado
• Técnicas utilizadas:
  • Microarreglos
  • Secuenciación masiva

Micro Arreglos

• Placa con múltiples pozos con ADN correspondiente a genes
• Obtener ARN, convertir en ADN y marcar con fluoróforos
• Hibridación y análisis de señales de fluorescencia
• Diferencia de fluorescencia indica la expresión diferenciada de genes

Secuenciación Masiva

• Fragmentación del ADN y conversión a ADN de doble hebra
• Secuenciación de pequeños fragmentos
• Alineación de secuencias con el genoma
• Representatividad de fragmentos indica nivel de expresión génica
• Almacenamiento de datos en bases de datos

Identificación de proteínas en diferentes muestras

Anticuerpos específicos

• Utilización para detectar proteínas específicas

Proteómica

• Electroforesis en dos dimensiones:
  • Separación por punto isoeléctrico y tamaño
  • Gradiente de pH y voltaje para la separación
  • Identificación de proteínas específicas mediante espectrometría de masa

Técnicas adicionales en biología molecular

• Inmunología
• Transgénesis
• Producción de proteínas recombinantes (anticuerpos, citocinas, etc.)

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Nota: Estas técnicas y datos pueden ser consultados en bases de datos para análisis adicional.