Aujourd'hui, on va étudier la technique histologique. La technique histologique, c'est en fait un ensemble d'étapes qui vont nous permettre de visualiser un certain prélèvement au microscope. Voyons voir grosso modo ces différentes étapes.
On va commencer par le prélèvement, ensuite la fixation, puis la déshydratation, puis l'inclusion, ensuite la microtomie, puis la coloration, et enfin... L'observation au microscope. On commence par la première étape qui est le prélèvement. On peut faire des prélèvements sur un cadavre, sinon ça peut être des pièces opératoires, et le plus souvent ce sont des petites pièces de biopsie. Lorsqu'on a notre prélèvement, on peut passer à la deuxième étape qui est la fixation.
L'intérêt de la fixation, c'est l'immobilisation des constituants cellulaires, le blocage des réactions enzymatiques. Prévenir la putréfication bactérienne post-mortem, permettre la technique histologique. Bon, grosso modo, ça veut dire qu'on va essayer de garder le tissu dans l'état le plus vivant possible pour qu'on puisse bien l'analyser plus tard. Le fixateur le plus commun en microscopie optique est le formol.
Et la quantité de fixateur utilisé doit être au moins 10 fois plus importante que le volume de tissu à fixer. Et ça, cette remarque, c'est très très important parce que si on n'a pas une quantité assez suffisante de fixateur, notre prélèvement ne sera pas fixé ou complètement fixé et donc il va se dégrader. Maintenant, on va imaginer qu'on a un vrai prélèvement.
Donc voilà, ce qui va se passer, c'est qu'on va le prendre, voilà, et on va le mettre dans cette petite boîte, dans le fixateur. Et si vous vous demandez combien de temps il va rester, ça dépend du type et du volume du prélèvement, et bien sûr aussi de la nature et du volume du fixateur. Pour des petites pièces comme celle-ci, ça peut prendre quelques heures.
Après fixation, on passe à la prochaine étape qui est la déshydratation. Cette déshydratation, c'est une étape très importante. Parce qu'en fait, la prochaine étape, c'est l'inclusion à la paraffine. La paraffine, c'est une matière qui est hydrophobe. Et le prélèvement, vu qu'il contient du formol, au fait, la paraffine ne pourra pas pénétrer dans ce prélèvement.
Le formol n'est pas miscible à la paraffine. Ce qu'on va faire, c'est qu'on va déshydrater ce prélèvement, on va nettoyer ce formol. On va commencer d'abord par des bains d'alcool de degré croissant, de 70 à 80. puis 100% voilà comme ceci donc là on a notre prélèvement on va le mettre à chaque fois dans un petit bocal jusqu'à 100% d'alcool et vu que l'alcool aussi il est non miscible à la paraffine on va utiliser maintenant le toluène qui est miscible à cette paraffine on va faire maintenant deux bains comme ceci et notre prélèvement il est prêt On passe maintenant à l'inclusion.
On va utiliser de la paraffine qui a été fondue à 56-58 degrés et on la place dans des petits moudres. A mi-remplissage, on va mettre le prélèvement et on va continuer à remplir avec la paraffine. On va laisser refroidir cette paraffine.
On peut utiliser des glaçons pour accélérer un petit peu. et à la fin on va obtenir des blocs de paraffine qu'on aura démoulé. On passe à la prochaine étape qui est la microtomie et pour cela on va utiliser un microtome. Il va faire avancer les blocs de paraffine et il va nous donner des coupes.
Voilà une coupe. Ces coupes mesurent environ 5 micromètres. C'est tellement fin qu'on peut même voir ce qu'il y a.
au travers. Donc l'ensemble des tranches vont former un ruban dans lequel on retrouve des coupes serrées de prélèvements tissulaires. Là notre prélèvement on ne peut pas vraiment le voir mais il se situe au centre de chaque petite lamelle de paraffine. Ce sera plus évident à la coloration. On continue maintenant.
Donc on passe à l'étalement et à la coloration. Donc pour l'étalement. On va étaler nos lames de paraffine sur des lames de verre et on va chauffer ces lames de verre sur une plaque chauffante.
Et c'est comme ça que la paraffine va coller à la lame. Pour passer à la coloration, c'est un petit peu délicat parce qu'en fait les colorants ne sont pas miscibles à la paraffine. Et donc ce qu'on va faire, c'est qu'on va faire les étapes qu'on a fait tout à l'heure mais dans le sens contraire. Donc on va faire un des paraffinages, on va passer les lames dans des bains de toluène afin de dissoudre la paraffine.
Donc voilà nos lames, on va les faire passer dans le toluène. Ensuite on va les réhydrater et pour cela on va passer les lames dans des bains d'alcool. de degrés décroissants cette fois-ci, c'est-à-dire de 100% à 70% d'alcool, voire 50 à 40%.
Maintenant, nos lames sont prêtes à la coloration. Et la coloration la plus utilisée en histologie, c'est la coloration de routine, c'est l'HES. C'est l'hématéine, l'éosine, le safran.
L'hématéine colore les noyaux en violet. L'éosine colore les cytoplasmes en rose. Le safran colore les fibres de collagène en jaune. On est arrivé à la dernière étape qui est l'observation, mais avant cela on va faire une petite étape qui est le montage.
Les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle avec une résine synthétique dont l'indice de réfraction est voisin à celui du verre. On va obtenir des lames qui peuvent être conservées pendant plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'années. Vous pouvez voir ici la lamelle. On a couvert notre prélèvement par-dessus et maintenant c'est beaucoup plus facile de le conserver.
Et on dispose aussi d'une préparation microscopique prête à être observée au microscope optique. Voilà donc ce qu'on va voir au microscope optique. Vous pouvez voir ici les couleurs de l'HES.
En sachant que ce prélèvement, c'était celui de la biopsie de la peau qu'on avait vu au début de vidéo. Donc là, on a l'épiderme, l'épithélium. Vous pouvez voir que les noyaux sont colorés en violet, le cytoplasme en rose.
Et le tissu conjonctif par dessous, vu qu'il y a beaucoup de fibres de collagène, il est coloré en jaune à l'aide du safran. Je sais que c'était lent, mais ce n'est pas fini. On a encore une dernière étape qui est l'étape la plus importante. On vient de le faire maintenant vu que j'ai interprété un peu les couleurs, mais voilà, c'est l'interprétation. L'interprétation donne une signification aux images observées.
Elle est basée sur des processus de reconnaissance de formes, de contrastes, de couleurs. Il faut aussi se méfier des artefacts et des images artificielles créées par la technique. Donc des fois on va avoir des petites erreurs lorsqu'on fait la technique histologique.
On a ici par exemple, lorsqu'on va observer ce prélèvement au microscope, on va voir ce vide ici. Et ça c'est pas quelque chose qui est physiologique en fait. Ça c'est...
Ça c'est en fait une déchirure qui est arrivée lors peut-être de l'étalement de la lame de paraffine sur la lame de verre, on ne sait pas. Mais ce qui est sûr c'est que ce n'est pas un prélèvement qu'on peut observer. Ici aussi on a des replis du tissu. Donc ce qu'on peut faire là c'est de reprendre une autre lame de paraffine et refaire l'étude sur elle.
Depuis tout à l'heure, on a cité les étapes de la technique histologique que pour le microscope optique. Alors pour le microscope électronique, le principe c'est le même, mais il y a une petite différence dans les produits et les machines qu'on va utiliser. D'abord, le fixateur qu'on utilise en microscopie électronique, c'est le glutaraldéhyde. On effectue ensuite une post-fixation à l'aide du tétraoxyde de smium afin d'obtenir de meilleures observations.
On utilise l'oxyde de propylène. Pour l'inclusion, on utilise des résines synthétiques d'époxy. Les coupes sont réalisées à l'aide d'un ultramicrotome avec un rasoir de verre ou de diamant qui va nous donner des coupes d'environ 80 nanomètres d'épaisseur. Et aussi, il faut savoir qu'il n'existe pas de technique de coloration en microscopie électronique, mais des techniques de contraste de tissu. On utilise fréquemment l'acétate d'uranile.
et le cétrate de Plan. Et enfin, en microscopie photonique, c'est un faisceau de photons qui va traverser nos coupes, mais dans le microscope électronique, c'est un faisceau d'électrons qui va remplacer le faisceau de photons. N'oubliez pas de vous abonner aux différents réseaux sociaux de Mitosis et de partager avec vos amis. A bientôt !