In diesem Video geht es um die Selektion transgener Zellen, ein Thema, das eingebettet ist in eine Videoreihe zum Thema Gentechnik und inhaltlich direkt verknüpft ist mit dem vorherigen Video zu den Methoden des Gentransfers. Wie ihr aus den vorherigen Videos erfahren habt, beschäftigt sich die Gentechnik mit Verfahren, mit denen man das Erbgut, die DNA von Organismen, gezielt künstlich verändern kann. Und häufig werden dabei Teile des Erbguts Guts auf einen anderen Organismus übertragen.
Mithilfe von Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, die DNA an bestimmten Stellen zu schneiden, wird das gewünschte DNA-Fragment von der gesamten genomischen DNA isoliert, anschließend in ein Transporter-Molekül, einem sogenannten Vektor, integriert, welcher in eine geeignete Wirtszelle, meist Bakterien wie Escherichia coli, eingeschleust werden kann. Als Vektoren werden häufig Plasmide genutzt. Das sind kleine DNA-Ringe von Bakterien.
Durch die Integration der Fremd-DNA in das Plasmid entsteht sogenannte rekombinante DNA, ein neu kombiniertes DNA-Molekül, das DNA aus mindestens zwei genetischen Ursprüngen enthält. Die Übertragung von genetischer Information in Bakterienzellen, wie hier durch das Einschleusen des Vektors in die Wirtszelle der Fall ist, wird auch als Transformation bezeichnet. Die transformierte Zelle ist durch diesen Vorgang und die Aufnahme von fremder DNA zugleich eine transgene, gentechnisch veränderte Zelle. Die Selektion transgener Zellen nutzt man zur Überprüfung, ob der Gentransfer erfolgreich war oder nicht. Man schaut sich an, wie man aus einer Vielzahl von Zellen diejenigen Zellen selektiert, ausfindig macht, die transgen sind und tatsächlich die Fremd-DNA in ihre Zelle integriert haben.
Tatsächlich ist ein erfolgreicher Gentransfer ein seltenes Ereignis. Nur eine von ca. 10.000 Zellen nimmt das Plasmid mitsamt Fremdgen auf.
Fehler können zum Beispiel beim Erzeugen rekombinanter DNA auftreten. Es kann sein, dass die Integration der Fremd-DNA in das Plasmid nicht gelingt. In diesem Fall enthält die Zielzelle zwar das Plasmid, allerdings ohne dem gewünschten Fremdgen.
Aber auch die Aufnahme des Plasmids durch die Wirtszelle muss nicht immer gelingen. Es kann also auch sein, dass der Wirtsorganismus das Plasmid gar nicht erst in seine Zelle aufgenommen hat. Nachvollziehbar, dass es von großer Bedeutung ist, diese wenigen transgenen Zellen zu selektieren, um mit ihnen anschließend weiterarbeiten zu können.
Für die Selektion macht man sich die Eigenschaft von Bakterien zunutze, dass ihre Plasmide häufig Gene für die Resistenz verschiedener Antibiotika enthalten. Beispielsweise trägt ein Plasmid Gene für eine Resistenz gegen die Arzneistoffe Ampicillin und gegen Tetrazyklin. Nicht verwunderlich, schließlich verwendet man Antibiotika bei bakteriellen Infektionen mit dem Ziel, die Bakterien abzutöten. Aus Sicht der Bakterien sind die Antibiotika ihre Feinde. Und so entwickelten sie im Laufe der Evolution Gene für die Resistenz gegenüber Antibiotika, um sich ihrer Feinde erwehren zu können.
Konkret erfolgt die Selektion wie folgt. Erkennungssequenzen für das Restriktionsenzym beim H1. Innerhalb der Antibiotika-Resistenz-Gene werden dafür genutzt, die DNA innerhalb einer der beiden Antibiotika-Resistenz-Gene zu schneiden und so das fremde Gen innerhalb des Gens zu integrieren.
Sollte das Plasmid nun tatsächlich das fremde Gen aufgenommen haben, zum Beispiel innerhalb des Ampicillin-Resistenz-Gens, würde die Resistenz gegenüber des Arzneistoffes Ampicillin verloren gehen. Klar. Denn das Gen ist infolge der Integration der fremden DNA komplett verändert, sodass es kein Genprodukt, nämlich die Resistenz gegenüber Ampicillin, herstellen kann. Das Gen für Tetrazyklinresistenz hingegen wäre weiterhin intakt und funktionsfähig.
Im nächsten Schritt werden die Wirtszellen des Experimentes, dazu gehören natürlich auch diejenigen, die das Plasmid ohne Fremdgen besitzen, sowie diejenigen ohne Plasmid, auf ein Nährmedium mit Tetrazyklin überführt. Zellen, die das Plasmid gar nicht erst aufgenommen haben, wachsen auf Tetrazyklin nicht, weil sie durch das fehlende Plasmid auch keine Antibiotika-Resistenz-Gene haben, deren Genprodukte sie gegenüber den Antibiotikum resistent machen würden. Somit ist es auch unerheblich, auf welches Nährmedium sie überführt werden.
Auch auf einem Ampicillin-Nährmedium würden sie kein Wachstum zeigen.. Anders verhält es sich bei Transgenzellen, deren Gentransfer erfolgreich war. Ihr intaktes Tetrazyklin-Resistenzgen bewirkt eine Resistenz gegenüber Tetrazyklin als Nährmedium, sodass diese Zellen auf ihrem eliminierten Feind wachsen können.
Trotzdem kann man nicht anhand des Wachstums von Wirtszellen auf Tetrazyklin mit Sicherheit ableiten, dass der Gentransfer bei den wachsenden Zellen erfolgreich war. Denn für den Fall, dass das Plasmid ohne Fremdgen in die Wirtszelle aufgenommen wurde, dann sind folglich beide Antibiotika-Resistenz-Gene intakt und auch diese Zelle würde wachsen. Nun muss also ein Schritt erfolgen, der die tatsächlich transgenen Zellen von denen, die das Plasmid ohne Fremdgen aufgenommen haben, selektiert. Die Selektion erfolgt, indem man die Zellen auf ein Nährmedium mit dem jeweils anderen Antibiotikum, in diesem Fall Ampicillin, überstempelt. Während die Zellen ohne Fremdgen infolge des funktionsfähigen Ampicillinresistenzgens gegenüber diesem Arzneistoff ausbilden und auf diesem wachsen, wurde dieses Resistenzgen im Fall eines erfolgreichen Gentransfers inaktiviert.
Es kann keine Resistenz gegen Ampicillin entwickeln und würde folglich nicht auf Ampicillin wachsen. Auf diese Weise, nämlich durch die Inaktivierung des Ampicillin-Resistenzgens, kann nachvollzogen werden, dass ein Gentransfer erfolgreich stattgefunden hat. Nicht umsonst werden die beiden Resistenzgene auch Reporter-Gene genannt. Denn wie Reporter berichten sie vom Vorhandensein. rekombinanter DNA in der betreffenden Zelle.
Letztendlich ist es egal, welches Nährmedium den Zellen als erstes und als zweites hinzugegeben wird. Man könnte sie ebenso zuerst auf ein Ampicillin-Nährmedium überführen. In diesem Fall würden sowohl Zellen ohne Plasmid und transgene Zellen kein Wachstum zeigen, sodass man diese zur Unterscheidung ebenfalls mithilfe der Stempeltechnik auf das jeweils andere Nährmedium überführen würde.