pero en este vídeo vamos a ver las bases de la citometría de flujo que es una técnica ampliamente utilizada tanto en clínica como en investigación entonces qué es la citometría de flujo la citometría de flujo evalúa las propiedades de refracción y dispersión lumínica así como la fluorescencia propia o de algún tipo de marcador que posee una célula o partícula conforme ésta pasa a través de un rayo de luz no sé qué parámetros medimos en la citometría de flujo vamos a medir la difracción la reflex la refracción y la fluorescencia y por ejemplo en el software skater vamos a medir la difracción de la luz y nos va a dar información en cuanto al tamaño celular y cómo vamos a ver diapositiva siguiente es detectada en dirección frontal en relación al láser por otro lado en el tsai scooter vamos a detectar la la refracción reflexión de la luz y esto nos va a proporcionar información en cuanto a la granularidad celular o sea la complejidad y interior de la célula y es detectada en un ángulo de 90 grados en relación al láser y a su vez vamos a tener detectores que van a a detectar la fluorescencia de las células entonces viendo un esquema de un citómetro vamos a tener que una suspensión celular va a pasar a una única célula a través del láser en dirección en frente al láser se va a detectar la difracción de la luz y eso nos va a dar idea del tamaño de las células en el fútbol scooter a 90 grados del láser se van a detectar la refracción y la reflexión de la luz y nos va a dar idea de la complejidad celular en el tsai scooter y a su vez va a tener diferentes detectores de fluorescencia para detectar la fluorescencia hay niveles distintos en distintas longitudes de onda esto a su vez está conectado a una computadora que va a permitir el procesamiento y y ni los datos y el análisis entonces como se trata de una muestra y cómo se analizan los resultados obtenidos entonces por ejemplo si nosotros queremos identificar en una suspensión celular células t cd4 y cd8 podemos utilizar anticuerpos que están conjugados afloró foros y anticuerpos contra cd8 conjugan un floor o foro anticuerpos anti cd3 conjugados a otro floor o foro y anticuerpos ãndice de 4 conjugados a otro floor o foro entonces nosotros incubamos las las células con con estos anticuerpos y entonces si se encuentran en la superficie en las células moléculas de 13 de 8 c de 4 los anticuerpos se van a unir y después nosotros vamos a poder detectar la fluorescencia y de eso flor offers entonces en el ejemplo de la imagen es una célula tc t cd8 estrés hace de 3 y cd8 entonces cuando incubamos con los anticuerpos los anticuerpos que reconocen sé de 3 y cd8 se van a unir y entonces después pero no los que reconocen antes no los los que reconocen sede 4 entonces la suspensión celular se pasa por el él citó metro cuando cada célula es interceptada por el láser se va a obtener información que se recolecta en diferentes sensores dentro de esto como dijimos lo primeramente vamos a obtener información en lo cuánto es su morfología entonces por el software y el sai scatter vamos a tener información en lo que esta mañana gran velocidad y entonces podemos identificar diferentes poblaciones celulares por ejemplo los linfocitos que son de pequeño tamaño de poco con pocos granulosos los monocitos que son un poco más grandes y un poco más granulosos que los linfocitos y los gránulos hitos que son más grandes y más granulosos entonces como dijimos queríamos identificar linfocitos t cd4 y cd8 entonces primeramente se vamos a identificar por morfología cuáles podrían ser los linfocitos entonces dijimos que los linfocitos seguían estos dãas los monocitos serían es esta población que se ve acá y los gránulos ito es una población más grande y más compleja entonces seleccionamos y los linfocitos y dentro de lo que suponemos que son linfocitos vamos a ver la expresión de los diferentes marcadores que utilizamos entonces por ejemplo acá en esta imagen está viendo la expresión de ese 3 entonces si los anticuerpos que reconocían ese de 3 y que estaban conjugados a un anticuerpo se unieron a esa célula esa célula va a florecer y va a florecer y entonces vamos a poder detectar la fluorescencia dada por los anticuerpos anti cd3 entonces en esta imagen vemos que hay una población que no expresa cd3 que no tiene fluorescencia a la longitud de onda que florece en el flúor o foro conjugado hace de 3 y una población que sí expresa hace de 3 y esas serían las de los linfocitos t entonces seleccionamos a los linfocitos t y dentro de estos linfocitos t queremos ver cuáles son cd8 y cuáles son c d4 para esto también vamos a ver la fluorescencia dada por los anticuerpos contra hace de 8 con jugados a un flor o foro y contra cd4 conjugado a otro flor o foro entonces como se puede ver en esta imagen tenemos aquí una población que no expresan y cd8 ni c4 después tenemos una población que expresa hace de 8 pero no expresa cd4 ven que es negativa para cd4 y una población que expresa hace 4 pero que no expresa hace de 8 ya que no tiene fluorescencia en la longitud de onda que florece el cloro foro conjugado al cde 8 y entonces de esa manera utilizando una diferente una con combinaciones diferentes de anticuerpo podemos determine y identificar diferentes poblaciones celulares en el este ejemplo serían linfocitos 13 8 y c 4 pero eso sí se puede realizar con cualquier tipo celular entonces además de de ese tipo de imágenes que se llaman dos blogs nosotros también podemos obtener gráficos de histogramas en donde vamos a ver el nivel de expresión de las moléculas por una célula entonces estos son ejemplos de histogramas obtenidos por x citometría de flujo en donde vemos por ejemplo en el caso del pd 1 el nivel de expresión de p de 1 en células de diferentes pacientes por ejemplo en la curva negra es un pase es en células t t cd8 de pacientes normales y en las otras curvas de células 13 8 d de pacientes con diferentes patologías por ejemplo con carcinoma hepatocelular entonces cuanto más moléculas de pd uno exprese una célula más anticuerpos se van a unir a esa célula y por lo tanto la intensidad media de fluorescencia va a ser mayor y por lo tanto la curva va a estar más corrida hacia el lado de la derecha es el ejemplo de la línea roja que expresa cada cada célula de cada linfocito t cd8 de un paciente con carcinoma hepatocelular expresa mayores niveles de an dp de 1 que las células t cd8 de pacientes de personas normales entonces la curva está corrida hacia la derecha lo que muestra un mayor nivel de expresión de pedí 1 entonces además de él ver si una célula expresa o no una molécula también podemos ver el nivel de expresión de esa molécula en por las células además por citometría de flujo también podemos separar células de nuestro interés por ejemplo si tuvieran si quisiéramos separar las células t cd8 de las células t cd4 a partir de de una suspensión celular por ejemplo d en sangre de sangre periférica marcando con anticuerpos eso nosotros vamos a poder identificar como les mostré recién las células t cd8 de las t cd4 y entonces le damos la orden al citómetro que es un citómetro especial a que cargue de forma diferencial gotitas que contienen cada una de esas células si entonces por ejemplo las acá las células verdes las cargas negativamente y las células azules las cargas positivamente entonces cuando se aplica un campo magnético las células verdes que están cargadas negativamente van a ir hacia el pueblo positivo y entonces logran y si nosotros ponemos un tubo ahí logramos recuperar todas las células verdes y en cambio si ponemos un tubo hacia el polo negativo vamos a recuperar todas las células que se cargaron positivamente ósea las células azules entonces de esta forma podemos separar células de manera específica entonces qué aplicaciones tiene la citometría de flujo y como dije tiene múltiples aplicaciones tanto en investigación como en clínica se puede utilizar para identificar caracterizar y separar poblaciones celulares para cuantificar específicamente células para analizar funciones celulares como la proliferación la fagocitosis y la apoptosis y también para conocer la cantidad de rn o adn que posee una célula entre otras aplicaciones bueno y eso sería todo muchas gracias