Estudio de la Hemoglobina

Introducción

• Hoy abordaremos la parte práctica del estudio de la hemoglobina de la Unidad 13 de Hemato Inmunología, enfocándonos en:
  • Los espectros de absorción de la hemoglobina
  • La detección de la hemoglobina falciforme utilizando técnicas de PCR

Hemoglobina

• Proteína con grupo hemo que absorbe luz
• Spectrum de absorción característico de 400-700 nm
  • Pico a 577 nm cuando está oxigenada (oximoglobina)
  • Pico a 630 nm cuando está oxidada (metahemoglobina)

Bioquímica Práctica

Espectros de Absorción

1. Oximoglobina (HbO2):

   • Registrar espectro de absorción en el rango de 500-700 nm
   • Calcular concentración usando ecuaciones de absorvancia:
     • Oximoglobina: 66 * Abs(577) - 80 * Abs(630)
     • Metahemoglobina: 279 * Abs(630) - 3 * Abs(577)

2. Desoximoglobina (Hb):

   • Usar dithionito de sodio para desoxigenar la hemoglobina
   • Registrar espectro de absorción post-desoxigenación
   • Comprobar reversibilidad con burbujas de oxígeno

3. Metahemoglobina (MetHb):

   • Agregar nitrito de sodio para oxidar la hemoglobina
   • Registrar espectros cada minuto durante 5 minutos

Estudios de PCR y Anemia Falciforme

1. Estructura y Mutaciones de la Hemoglobina:

   • Hemoglobina adulta: 2 cadenas alfa y 2 cadenas beta
   • Anemia falciforme: mutación en el gen beta (Glu a Val en el sexto aminoácido)
   • Técnica de PCR para amplificar la región específica y realizar análisis por enzima de restricción

2. Procedimiento Experimental:

   • PCR:
     • Utilizar cebadores para amplificar una porción del gen
     • Ingredientes: ADN molde, cebadores, dNTPs, Taq polimerasa
     • Fases: Deniaturación, Anillado, Extensión (multiples ciclos)
   • Digestión por Enzima de Restricción:
     • Utilizar enzima específica que corta solo si la mutación está presente

3. Análisis por Electroforesis de Gel de Agarosa:

   • Separar fragmentos de ADN por tamaño en un campo eléctrico
   • Resultados esperados:
     • Individuo sano: una sola banda grande
     • Control con anemia falciforme: dos bandas (una más pequeña)
   • Uso de marcador de peso molecular para comparar tamaños

4. Precauciones:

   • Uso de bromuro de etidio: manipulación cuidadosa con guantes

Presentación de Resultados

• Fecha de presentación: Viernes 29 durante la clase
• Cada grupo presentará sus resultados obtenidos en el práctico
• Se otorgarán puntos basándose en la performance durante el experimento