bienvenidos a la elaboración del práctico del estudio de la hemoglobina de la unidad 13 de hemato inmunología esta sería la parte de práctico de bioquímica donde estudiaremos los espectro de absorción de hemoglobina y además detectaremos la hemoglobina falsa y forme utilizando técnicas de peces en la introducción teórica que se encuentra en el protocolo disponible en su nueva nos habla de la hemoglobina y su estructura su concentración y habla de las propiedades espectro fotométricas de la misma nos cuenta que es una proteína que absorbe luz y este nos explica las propiedades de absorción de las proteínas en particular esta proteína que tiene un grupo de moss que absorbe con una alta con un alto valor y luego vamos a hablar de lo que se llaman espectros de absorción los espectros de absorción en sustancias que absorben la luz tiene unas propiedades características en el caso de la bobina tiene un espectro muy característico sobre todo como ya mencioné anteriormente por el grupo hemo que posee él el espectro característico de la hemoglobina se encuentra en el rango de los 400 o 500 nanómetros hasta los 700 nanómetros presentando picos característicos dependiendo del estado en el que esté la hemoglobina por ejemplo si de malvinas se encuentra oxigenada el pico mayoritario se encuentra de 577 nanómetros si la hemoglobina se encuentra oxidada o sea en forma de metano globina el pico característico o mayoritario que en realidad es más como un hombre se encuentra a 630 y sobre todo se distingue con respecto a ser para la próxima lobina por él por la falta de observancia que tiene la ocs y molina a estos 630 granos entonces eso es la primera parte del práctico donde se estudiarán las las propiedades espectros fotométricas de la hemoglobina que lo vamos a mencionar en profundidad dentro de unos dentro de unos minutos por otra parte como mencioné al principio se realizará también es un estudio de por pcr de la de la presencia del animal se informe entonces vamos a ver qué es la anemia falciforme y qué son los genes de la hemoglobina y demás y todavía no sé estudio pero cuando vean los teóricos van a ver que la hemoglobina en realidad se corresponde en cuatro cadenas colectivas y en realidad a lo largo del desarrollo se expresan diferentes tipos de cadenas asociadas a diferentes tipos de genes a nivel embrionario hay un tipo luego a nivel fetal hay otro tipo y la hemoglobina adulta es que esa característica la que poseemos durante la mayoría de nuestra vida se corresponde de los genes alfa y beta un mármol obinna normal adulta tiene dos cadenas alfa y dos cadenas beta existe una mutación se genera una mutación que no ha cambiado a lo largo de la evolución que tiene una sola mutación de una sola base una de mina por una timina en el séptimo codón del gen beta y eso genera un cambio en el sexto aminoácido de la cadena venta esa mutación puntual hace que en vez de tener un ácido glutámico que es un aminoácido ácido se genera un havalina qué es un aminoácido a polar esto genera que queremos cambiar la estructura de la bobina y hace que en frente a diferentes cambios en el trocito estamos lobina pueda precipitar y genere lo que se llama la forma y lóbulos rojos en forma de ojos por eso es que se denomina este tipo de desorden el consell y anemia os en inglés se dice entonces puntualmente la mutación es en este punto entonces lo que vamos a hacer es utilizar la técnica de pcr primero para y amplificar la zona que queremos estudiar y luego utilizaremos un ensayo que se llama de restricción donde tenemos una enzima de restricción no sea una enzima que corta en la secuencia específica así que la secuencia específica que reconoce esta enzima de restricción incluye la mutación de anemia falciforme eso qué quiere decir que si yo tengo la mutación de la anemia falciforme la enzima de restricción va a encontrar la secuencia que corta y va corta si yo no tengo la mutación la enzima no va a cortar porque no va a encontrar la secuencia correcta para la para el corte de esta enzima que es muy específica bueno entonces vamos a ir un poquito al procedimiento experimental que el procedimiento experimental vamos a empezar primero con los espectro de absorción donde vamos a estudiar tres tipos de módulo bina diferentes dentro de vamos a convertir la de los tres tipos primero vamos a hacer el espectro de la ocs y modelo bean a la próxima o lumina es la hemoglobina que tiene oxígeno y por lo tanto vamos a mantener el práctico y quien también un color característico rojo sí entonces primero vamos a calcular la concentración que como siempre tenemos una porción de óxido globina y la porción de metahemoglobina vamos a calcular cuánto tenemos para iniciar el procedimiento de oxy y de meta para eso vamos a generar una ilusión como se explica en el protocolo y vamos luego midiendo a 577 nanómetros y a 630 nanómetros a calcular qué proporción tengo de óximo globina y qué proporción tengo de meta molina como se calcula eso utilizando estas ecuaciones que están acá la óptima iluminada se calcula como que nos va a dar el resultado de un micro molar como 66 x el valor de absorban sé que yo tengo vientos 27 nanómetros menos 80 x la observancia que yo tengo 630 de nosotros eso nos va a dar un valor de óptimo globina y para lamentamos lobina hacemos lo mismo pero con la ecuación correspondiente lamentamos lo mismo lo cual es igual a 279 por la concentración hace del absorba hacia 630 menos 3 por la observancia de 577 eso nos va a dar qué cantidad tenemos la ocs y molina y cantidad tenemos de metahemoglobina en realidad nosotros vamos a tener probablemente en una mayoría de oxy movida para comenzar luego vamos a hacer un espectro de la de la ocs y mal ovina en el rango de 500 o 700 nanómetros y bueno vamos a guardar sus espectros para después ver cuáles fueron los picos característicos de la misma luego se realizará el espectro de la de shocks y móvil para eso se utilizará mi delito de sodio a su productor que lo que compite por el oxígeno y lo que hace es eliminar oxígeno unido a la hemoglobina entonces vamos a ver vamos a observar un cambio de color y vamos a usar un cambio en el espectro lo mismo vamos a agregarle el dijon hito y luego vamos a hacer un espectro de 500 o 700 93 y ahí también vamos a ver cómo cambia y cuáles son los picos nuevos en el caso de la de shocks hemoglobina para comprobar la reversibilidad porque la obviamente la hemoglobina puedes oxigenarse y luego re oxigenarse vamos a burbujear oxígeno o aire dentro del tubo con lo cual vamos a ver y vamos a volver a hacer un espectro y ver es si se recuperó por lo menos parcialmente el espectro característico de la ocs y molina que últimos anterior por todo el último experimento que haremos en el caso de los espectros se le habla a la metamos lobina en el caso de la metamos globina lo que haremos es agregarle el nitrito de sodio que puede oxidar al demo lobina y vamos a ver registrar la absorban cya usar el espectro de observancia de 500 o 700 km igual que antes pero todos los aspectos cada 1 minuto durante 5 minutos y vamos a ver cómo se modifica el espectro desde la próxima o lobina hacia la meta hemoglobina en la segunda parte que va a ser en realidad la parte más larga eso es un práctico que tiene que durar tres horas si la parte mayoritaria va a la parte del pcr lo que haremos es la pcr del gen de la beta globina y vamos a detectar la mutación por una enzima de restricción como expliqué anteriormente entonces para la realización de la pcr tenemos cebadores que lo que hacen es tenemos todo el gen de la hemoglobina pero solamente vamos a elegir amplificar una porción chiquita si para eso lo que tenemos son cebadores o oligonucleótidos que lo que hacen es unirse a pedacitos del gen en cada uno de los belgas los extremos de lo que queremos estudiar y vamos a amplificar esa parte para eso le vamos a poner una enzima que es una de la polimerasa el molde de adn de genbeta de la bobina de la hemoglobina vamos a ponerle bueno los cebadores como dijimos y vamos a ponerle de shocks y nucleótidos trifosfato que van a ser los que van a hacer las bases para unir para generar el adn en los fragmentos chiquitos de adn que se van a aplicar para eso bueno la pcr que se desarrollan tres pasos que se encuentran explicados en el protocolo este y acá mostramos en la tabla mostramos cuánto tenemos que agregar de cada cosa acuérdense que en las pcs se manejan valores muy chiquitos de volúmenes con lo cual vamos a tener que preparar primero una muestra vamos a utilizar poquitos un volumen de 5 32 microlitros este y luego vamos a a generar nuestras diferentes cuentas cuales son las muestras que vamos a estudiar va a ser primero un control del individuo sano le vamos a tener un control que ya sabemos que tienen m falciforme y luego vamos a tener dos muestras problemas que no sabemos que tiene pueden ser pueden ser sino mutaciones o con la mutación y por último se tener un control negativo que no tiene de sí entonces tenemos nuestra mezcla que fue la que hicimos al principio en esa tablita y vamos a poner 46 microlitros en cada uno de los tres tubitos y vamos a hacer la pecera la pcr consta de diferentes pasos de temperaturas que permiten separar el adn permiten que la tac polimerasa pueda actuar o que aumente y luego se hacen una cierta cantidad de ciclos que permiten que esos que pasamos de unas poquitas copias del gen a tener muchísimas copias de la pequeña parte del gen que simplificamos por peces esta pesada dura aproximadamente 30 minutos y luego vamos a tener el producto de peces es el producto de pcr lo que vamos a hacer es justamente la digestión como les expliqué anteriormente la base de la detección de nuestro de nuestro experimento va a ser que tenemos una enzima que es la 81 l 81 y perdón creo que hace es se encuentra la mutación no se encuentra las secuencias que tiene la mutación d de la anemia falciforme va a cortar entonces si yo tengo una secuencia de un fragmento de pcr que tiene nuestra nuestra votación voy a tener un fragmento más chiquito porque porque va a ser cortado de los dos fragmentos muy chiquitos uno muy chiquito y uno menos chico y luego voy a tener si en el caso de la normal o sea el que no tiene una mutación de tener un solo fragmento grande entonces para hacer la digestión se agarra el producto de pcr y se agarra la enzima de restricción y se va a poner a digerir luego como se va a ver esto se va a ver en un electroforesis de agarosa en la barrosa ya que la dncd molécula grande se va a recorrer en un gel de agarosa como ya vimos en otros otros momentos los giles lo que hacen es básicamente la es electroforesis lo que hacen es mover moléculas en un medio en base a un campo eléctrico en el caso de este en este caso va a ser la molécula base de adn se van a poner en agarosa y va a correr hacer polo positivo entonces lo que vamos a ver en caso de nuestro nuestros resultados vamos a ver un control que va a tener una sola una sola banda una 1 una muestra que ya sabemos control que tiene me parece que va a tener una banda más chiquita y otra más más chiquita y luego vamos a tener nuestra nuestra prueba que no sabemos qué va tenemos sí cómo vamos a ver los tamaños que tienen cada uno porque esta visión es digo más chico más grande va a tener que ser explicado con tamaños pero como sabemos cuál son los tamaños vamos a utilizar un marcador de peso molecular que nos va a mostrar el tamaño en pares de bases de nuestro producto sí entonces ahí comparando en el gel vamos a correr al mismo tiempo que nuestras muestra vamos a correr el marcador de peso y vamos a ver cuáles son los tamaños donde nos quedaron nuestras muestras este problema hay que tener en cuenta que para él para ver los resultados vamos a tener que utilizar un trans iluminador ultravioleta pero vamos a utilizar un producto que se llama glóbulos decidió que tiene que es que se intercala en el adn por su capacidad de intercalarse en el adn es muy importante tener muchísimo cuidado con este producto y utilizar siempre guantes cuando se manipulen estas cuentas luego se va fotografía de gel se va a calcular el peso molecular de cada una de las muestras y luego se van a analizar los resultados los resultados se presentarán el viernes 29 durante la clase en el lugar en vez de cuando cuando sus compañeros van a presentar el seminario o la ola o los talleres en realidad a las personas que les tocó él y práctico van a presentar los resultados obtenidos en este práctico esa va a ser su presentación donde obtendrán los puntos en base también a la performance envío práctico